靈杞黃斑顆粒含藥血清預處理對人視網膜色素上皮細胞衰老的保護作用

劉曉娟 姜海濤 尹莉莉 吳星偉 顧 青

年齡相關性黃斑變性（age-related macular de generation，AMD）是發達國家50歲以上人群致盲的首要原因。目前認為視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞的氧化應激與干性AMD發病密切相關，而氧化應激能夠誘導或加速細胞衰老的發生。因此，氧化應激誘導的RPE細胞衰老模型是研究此類疾病發病機制和治療方法的一個切入點。目前干性AMD病因并未完全明了，迄今為止未有明確有效的治療方法來提高視力或防止視力惡化，也無有效的預防措施。本實驗中靈杞黃斑顆粒（Lingqi Huangban Granula，LQHB）是我們自制的復方中藥顆粒沖劑〔1〕，已應用于臨床十多年，主要用于年齡相關性黃斑變性以及其他各類視網膜變性類疾病。本實驗采用血清藥理學方法〔2〕，通過探討中藥LQHB含藥血清預處理對氧化應激誘導的人RPE細胞衰老損傷的保護作用，為臨床應用提供客觀實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人視網膜色素上皮細胞株（ARPE l9，美國），將凍存的RPE細胞株，通過復蘇、接種、培養、消化后，獲得單細胞懸液備用。30%H2O2（上海虹光化工廠），DMEM培養基、F12培養基、10%胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素（上述均購自美國GIBCO公司）、MTS（Promega 公司）、DMSO（分析純）、細胞周期檢測試劑盒和細胞衰老檢測試劑盒（碧云天公司）。高速冷凍離心機（Zentmifugen Hettich 公司）、Eppendorf管（Eppendorf公司）、4 ℃冰箱（青島海爾公司）、CO2細胞培養箱（Sanyo公司）、細胞培養板（Nunc公司）、DK-8A型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）、超潔凈工作臺（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、流式細胞儀（Pharmacia Biotech公司）、分光光度儀（HACH，USA）。實驗動物雄性SD大鼠24只，清潔級，體重220～230 g，購于中國科學院上海實驗動物中心。動物合格證號：SCXK（滬）2008-0016。LQHB（滬藥制字Z05050795，上海市藥監局醫院制劑認證。生產批號：20100101，上海練塘中藥廠生產，規格15 g/包，含生藥53 g／包。主要組成（質量比例）：當歸10份、川芎10份、菟絲子10份、靈芝10份、蒼術10份、丹參10份、黨參10份、海藻10份、肉蓯蓉15份、枸杞子l0份。

實驗動物購回后于實驗動物房適應性飼養，自由攝水飲食，籠養。24只SD大鼠隨機分成中藥血清組（16只）和空白血清組（8只），中藥血清組又分為低劑量組和高劑量組，每組8只。采用灌胃方式給藥，依據動物與人體的每千克體質量劑量折算系數表，每次低劑量組和高劑量組的給藥劑量分別為3.125 g/kg 和 6.25g/kg，分 2 次給藥（8 時，20 時），連續 3d〔3〕。空白血清組予以同等量生理鹽水灌胃。末次喂藥前禁食12 h，灌藥后1~2 h內無菌條件下腹主動脈取血。空白血清組同一時間點取血。取血后4℃冰箱中靜置過夜，3000 r/min，25 min離心，取上清液并將同組別的不同大鼠血清混合。經56℃，30 min滅活分裝，并于超凈臺內0.22 μm針式濾過器過濾分裝，-20℃冰箱貯存備用。

1.2 MTS法檢測細胞活力

1.2.1 細胞制備：將RPE細胞以2.5×104個/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μl，加入含10%FBS的DMEM/F12培養液置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，細胞達80%～90%后取出。

1.2.2 分組培養：（1）棄上清液，PBS沖洗2次后分5組：分別為正常對照組（normal control，NC）、模型組（model，M）、空白血清組（model+Blank serum group,MB）以及低劑量含藥血清組（model+low-dose LQHB group，ML）、高劑量含藥血清組（model+high-dose LQHB group，MH），各組均加入無血清 DMEM/F12培養液，血清組分別加入含10%的制備空白血清，低、高劑量含藥血清，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后取出。（2）棄上清液，PBS沖洗2次后分別于模型組，空白血清組，低、高劑量含藥血清組4組每孔加入 H2O2，使 H2O2終濃度為 150 μmol／L，繼續置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養2 h。（3）棄上清液，PBS沖洗2次后加入無血清DMEM/F12培養液，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h。

1.2.3 MTS法檢測：將20μl MTS直接加入培養板孔的培養基中，繼續培養2 h。搖床上放置5 min，490 nm分光光度儀上機檢測。每組6個復孔，實驗重復3次。

1.3 流式細胞儀檢測細胞周期

1.3.1 細胞制備：將RPE細胞以1×106個/ml密度接種于培養皿，加入含10%FBS的DMEM/F12培養液置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，細胞達80%～90%后取出。

1.3.2 分組培養：棄上清液，PBS沖洗2次后分組，步驟方法同1.2.2。

1.3.3 流式細胞儀檢測：用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，按照細胞周期檢測試劑盒說明操作。上流式細胞儀檢測。應用Cell Quest軟件包中的Modifit LT 2.0軟件處理，進行細胞周期分析。

1.4 細胞衰老的檢測

1.4.1 細胞制備：將RPE細胞以8×104個/ml密度接種于置有小玻片的24孔板，加入含10%FBS的DMEM/F12 培養液 500 μl置于 37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，細胞達70%～80%后取出。

1.4.2 分組培養：棄上清液，PBS沖洗2次后分組，步驟方法同1.2.2。

1.4.3 細胞衰老檢測：（1）棄上清液，PBS洗滌3 min×3遍，按照碧云天細胞衰老檢測試劑盒說明書操作。（2）37℃濕盒內孵育過夜后用伊紅套染未著色細胞胞漿，普通光學顯微鏡下觀察并拍照，在顯微鏡（×400倍）下進行細胞計數，隨機選取陽性細胞分布均勻的區域，每組檢查10個視野，每個視野數出總細胞數和陽性細胞數，計算出陽性細胞的百分比，即為衰老細胞百分率。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 LQHB含藥血清對RPE細胞活力的影響

高、低劑量LQHB含藥血清組的光密度值低于正常對照組，高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），而空白血清組與模型組之間差異無統計學意義（P>0.05）（表 1）。

表1 MTS法測定各組RPE細胞的光密度值[D（492nm），±s]

表1 MTS法測定各組RPE細胞的光密度值[D（492nm），±s]

注：與正常對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P＞0.05，③P<0.05；與低劑量組比較，④P＞0.05。以P<0.05為差異有統計學意義（方差分析并做SNK-q檢驗）

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2.2 LQHB含藥血清對RPE細胞周期的影響

高、低劑量LQHB含藥血清組處于G1期的RPE細胞比例低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），而空白血清組與模型組之間無顯著性差異（P>0.05）（表 2）。

表2 流式細胞儀檢測各組RPE細胞G1期構成比例（±s，%）

表2 流式細胞儀檢測各組RPE細胞G1期構成比例（±s，%）

注：與正常對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P＞0.05，③P<0.05；與低劑量組比較，④P＞0.05。以P<0.05為差異有統計學意義（方差分析并做SNK-q檢驗）

組別 樣本數 G1期比例正常對照組 100 81.83±2.05模型組 100 88.23±1.92①空白血清組 100 87.44±1.22①②低劑量含藥血清組 100 83.63±0.84③高劑量含藥血清組 100 84.52±1.03③④

2.3 細胞衰老的檢測[衰老相關-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色]

高、低劑量LQHB含藥血清組衰老細胞所占比例均較模型組低，差異有統計學意義（P<0.05），而空白血清組與模型組之間差異無統計學意義（P>0.05）（表 3）。

表3 SA-β-Gal染色法檢測各組衰老RPE細胞的比例（±s，%）

表3 SA-β-Gal染色法檢測各組衰老RPE細胞的比例（±s，%）

注：與正常對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P＞0.05，③P<0.05；與低劑量組比較，④P＞0.05。以P<0.05為差異有統計學意義（方差分析并做SNK-q檢驗）。SA-β-Gal：衰老相關-β-半乳糖苷酶

組別 樣本數 衰老細胞比例正常對照組 100 5.54±0.84模型組 100 70.64±2.23①空白血清組 100 68.94±1.32①②低劑量含藥血清組 100 46.53±1.56③高劑量含藥血清組 100 41.09±1.03③④

3 討論

AMD是以RPE細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）堆積引起的以Bruch’s膜增厚為特征的一類疾病。雖然其視力損害的原因在于光感受器功能失調，但發病卻始于RPE細胞的衰老。通過外源性加入H2O2誘導是目前較公認和成熟的研究細胞衰老的一種方法〔4-6〕。盡管干性AMD的發病率高，對視力影響嚴重，但可以得到治療的患者卻很有限。祖國醫學在治療干性AMD方面進行了積極的探索，研究證實一些中藥單體和復方治療干性AMD取得了一定的療效，顯示了中醫藥治療的獨特優勢。LQHB已在我院眼科15年臨床應用中取得較好療效，前期實驗研究發現：LQHB能夠明顯減輕光損傷引起的大鼠視網膜氧化應激損傷〔7〕；對缺氧引起的RPE細胞損傷具有一定的保護作用〔8〕；能夠抑制光損傷引起的感光細胞凋亡和神經膠質細胞增生；改善ERG的b波與振蕩電位（OPs）振幅及潛伏期，提示LQHB具有抗氧化作用，能夠通過改善視網膜神經組織細胞的生物循環與代謝而緩解病情，展現了對干性AMD良好的治療前景〔9〕。

研究認為衰老的RPE細胞具有如下特征：包括細胞肥大，衰老相關-β-半乳糖苷酶活性增高，細胞生長停止以及細胞周期停滯在G1期〔10-11〕。細胞衰老最顯著的特征是細胞在很長一段時間內仍然維持代謝活性，但因阻滯于G1期，失去了對有絲分裂原的反應能力和合成DNA的能力，不能進入S期，本實驗驗證了這一點，并發現LQHB含藥血清預處理能夠減緩其衰老。SA-β-Gal染色活性檢測以X-Gal為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會生成深藍色產物，從而在光學顯微鏡下很容易觀察到變成藍色的表達β-半乳糖苷酶的細胞或組織。在本實驗中LQHB含藥血清組著色呈藍色的衰老RPE細胞比例遠少于模型組（70%）。空白血清組的各項檢測結果與模型組無明顯差異，而高、低劑量組間各結果比較亦無統計學意義的差異，其原因有待進一步研究。

本文初步闡明了靈杞黃斑顆粒含藥血清預處理對人RPE細胞衰老損傷的保護作用，其具體作用機制仍需進一步研究。

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