HIF－1α及CAⅨ在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

夏 丹

（山東醫學高等專科學校 病理教研室，山東 臨沂276000）

研究發現腫瘤的發生發展與缺氧的微環境密切相關，缺氧或酸性內環境容易使細胞發生自發突變，從而促進腫瘤發生。HIF－1α是缺氧反應的關鍵調節劑，可增加血管生成而啟動腫瘤發生，介導上皮間質轉化，上調缺氧相關基因，促進腫瘤發展。CAⅨ是近來發現的檢測細胞缺氧的重要指標，CAⅨ可以控制酸的上調，促進腫瘤細胞在缺氧微環境中生存，使其成為腫瘤治療的潛在靶標蛋白［1］。我們用免疫組化法檢測HIF－1α、CAⅨ在乳腺癌中的表達，探討其在乳腺癌中表達的意義。

1 材料與方法

1.1 標本 取自山東醫學高等專科學校附屬醫院1998年－2011年乳腺手術切除的腫瘤組織及其鄰近的正常組織。術后組織用福爾馬林固定，石蠟包埋。病人有一例為男性，其余均為女性。年齡29－72歲，中位年齡49歲。

1.2 試劑 HIF－1α、CAⅨ一抗，鼠兔通用二步法二抗PV－6000，DAB顯色劑均購于北京中杉金橋公司。

1.3 檢測方法 組織常規10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm厚連續切片分別用于HE及免疫組化。免疫組化染色步驟：①二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，采用枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）進行微波熱修復20min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次5 min，0.3%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶10 min，PBS沖洗3次，每次5min，分別滴加 HIF－1Α、CAⅨ一抗，4℃過夜。②復溫1h，PBS沖洗3次，每次5min，滴加二抗，2h行DAB顯色，顯微鏡觀察5－10min。③蒸餾水沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗2h，梯度酒精干燥，二甲苯透明，中性樹脂封固。設立陰性、陽性對照。

1.4 結果判定 CAⅨ主要為細胞膜著色，部分CAⅨ細胞漿著色。HIF－1α主要為細胞漿著色，部分細胞同時存在核染色。腫瘤組織染色結果判定標準：①根據染色細胞計數。隨機觀察5個高倍視野，計數500個細胞中陽性細胞所占百分比，分為5級：0分，染色細胞＜5%；1分，染色細胞5%－25%；2分，染色細胞25%－50%；3分，染色細胞50%－75%；4分，染色細胞＞75%。②根據染色強度分為4級：0分，不著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，深棕色。每份切片記分＝染色細胞數分數＋染色強度分數。所得分數≤1分為陰性結果，2－3分為“＋ ”，4－5分為“＋＋ ”，6－7分為“＋＋＋”。“＋”計為低表達，“＋＋”、“＋＋＋”計為高表達。

1.5 統計學處理 采用卡方檢驗，以P＜0.05作為差異性有顯著性的檢驗標準。數據用SPSS 14.0統計軟件包進行處理。

2 結果

2.1 HIF－1α在乳腺癌中的表達

88例乳腺癌組織中，有68例檢測到HIF－1α陽性表達，陽性率為77%，其中31例呈低表達，低表達率為35%，37例呈高表達，高表達率為42%（見表1）。HIF－1α大部分表達在胞漿，部分同時在胞核中表達。（如圖1）

2.2 CAⅨ在乳腺癌中的表達

88例乳腺癌組織中，有51例檢測到CAⅨ陽性表達，陽性率為58%，其中32例呈低表達，低表達率為36%，19例呈高表達，高表達率為22%（見表1）。CAⅨ大部分為胞膜著色，也有胞漿著色的。腫瘤細胞著色，間質細胞不著色。（如圖2）

圖2 CAⅨ在乳腺癌中的陽性表達 （SP，×200）

表1 HIF－1α、CAⅨ蛋白在乳腺腫瘤組織及癌旁正常組織中的表達

（HIF－1α、CAⅨ蛋白在癌旁正常組織及乳腺癌中的表達均具有顯著差異，P＜0.01）

2.3 HIF－1α、CAⅨ與其它病理特征的關系

HIF－1α、CAⅨ表達與腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移密切相關，組織學分級越高，表達越強，與年齡無關，二者表達有明顯相關性。

3 討論

碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ，CAⅨ）是碳酸酐酶家族（Carbonic anhydrase，CAs）的異構體之一，最早是在人宮頸癌Hela細胞系中發現的，主要分布于細胞膜。成熟的CAⅨ由具有N端獨特的蛋白多糖領域、細胞外區、跨膜區和細胞內C末端4個不同區域組成，是一種與腫瘤相關的跨膜糖蛋白［2］。近來有研究［3］顯示，活體腫瘤細胞中的碳酸酐酶可以使瘤細胞外pH值下降，從而使胞內pH值保持穩定，因此細胞能耐受缺氧。此外酸性細胞外微環境可以促進整合素激活，影響細胞的黏附和遷移［4］。最近研究表明，低pH值可促進誘導腫瘤干細胞表型，從而更好地保持腫瘤的細胞異質性［5］。CAⅨ在調節腫瘤pH值方面的重要性提示CAⅨ可能成為有用的腫瘤標記物［6］。Brickton［7］研究表明，CAⅨ在口腔鱗狀細胞癌中呈現高表達，并與淋巴結轉移和術后生存降低密切相關。Choschzick［8］研究結果顯示CAⅨ的過度表達是子宮內膜樣卵巢癌的一個獨立預后不良指標。在我們研究中，CAⅨ在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達率分別為58%、13%，CAⅨ在癌組織中表達率明顯升高，并且腫瘤分化程度越差、有淋巴結轉移及腫瘤組織體積越大，CAⅨ陽性率越高。這一結果提示CAⅨ表達陽性的腫瘤細胞更具有生長、浸潤轉移的優勢。

表2 HIF－1α、CAⅨ與其它病理特征的關系

缺氧誘導因子－lα（hypoxia inducible factor lα，HIF－1α）在人體內廣泛存在，是氧穩態和缺氧反應調節的一種轉錄因子。最近有報道，缺氧激活NF－κB／HIF－1α／VEGF通路，通過增加血管生成而啟動腫瘤發生［9］。Yoo等［10］研究顯示，HIF－1α可介導上皮間質轉化，并促進腫瘤進展。Ma等［11］推測，上皮間質轉化的調節紊亂可能在缺氧誘導的血管生成擬態中發揮作用。Mathieu等［12］研究表明，缺氧通過HIF誘導人類胚胎干細胞標志物在多種腫瘤中表達。Qiang等［13］發現，HIF－1α通過 Notch信號通路維持缺氧介導的成膠質細胞瘤干細胞特性。上海藥物所丁健課題組研究發現轉錄因子c－Jun結合于HIF－1α的ODD結構域，減少HIF－1α蛋白的泛素化修飾與降解，穩定HIF－1α蛋白，增強其轉錄作用，促進其介導的腫瘤血管新生過程，為HIF－1α靶向治療提供了新的思路。在我們研究中，HIF－1α在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達率分別為77%、17%，HIF－1α在癌組織中表達率明顯升高，并且與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及腫瘤體積密切相關。

我們研究發現，乳腺癌組織中CAⅨ表達與H IF－1α表達具有明顯相關性，提示CAⅨ、HIF－1α可能共同促進乳腺癌侵襲轉移。現在研究認為CAⅨ的啟動子含有HIF－1α結合域－缺氧反應元件，在正常情況下羥基化形式的HIF－1α能與VHL蛋白結合，從而被E3泛素連接酶識別并迅速降解。在缺氧情況下，HIF－1α呈非羥基化形式，不能被E3泛素連接酶識別并降解，造成HIF－1α積聚，引發CAⅨ高表達［14］。Mconald等［15］用 CAⅨ單克隆抗體和特異性CAⅨ小分子抑制劑干擾CAⅨ的活性，破壞癌細胞PH調節，最近已被證明損害原發腫瘤的生長和轉移。Petrul等［16］用針對CAⅨ的抗體藥物共軛BAY 79－4620能有效對抗CAⅨ陽性的裸鼠移植腫瘤，腫瘤體積完整或部分縮小，甚至用單劑量就可以達到療效。許多這些藥物在臨床前或臨床發展，構成了一種新型的癌癥治療有針對性的戰略。

綜上所述，HIF－1α、CAⅨ在乳腺癌組織中的表達明顯升高，其表達與患者淋巴結轉移、腫瘤大小和組織學分級呈明顯正相關，可能介導了乳腺癌淋巴結轉移及其進展，通過檢測HIF－1α、CAⅨ的表達有助于評估乳腺癌的淋巴結轉移情況及預后判斷。

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