不同抗原含量雞減蛋綜合征滅活疫苗的HI效價測定

邵攀峰，余彬輝，何葉峰，李少麗，王斌卿，胡志航，朱國坡

(杭州薦量獸用生物制品有限公司，杭州 310018)

雞減蛋綜合征是由雞減蛋綜合征病毒(EDSV－76)引起的以產生薄殼或無殼蛋，產蛋率嚴重下降為主要特征的傳染病。自1976年荷蘭科學家Van Eck等首次報道以來，許多國家及地區都報道了此病的流行，此病已成為當今世界范圍內引起產蛋損失的主要原因之一［1］。目前，國內外均采用油乳劑滅活疫苗預防本病。為了減少因免疫次數多對雞群的應激反應，近年來國內對聯苗的研究也更加重視［2］。

本實驗通過對雞減蛋綜合征病毒液高倍濃縮，然后根據不同稀釋濃度抗原含量制備滅活疫苗，研究其抗體效價水平，為雞減蛋綜合征滅活疫苗，特別是雞新城疫－減蛋綜合征二聯滅活疫苗、雞新城疫－傳染性支氣管炎－減蛋綜合征三聯滅活疫苗、雞新城疫－傳染性支氣管炎－減蛋綜合征－禽流感四聯滅活疫苗等與雞減蛋綜合征相關的多聯滅活疫苗的研發及生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒種及抗原 EDSV HE02株生產毒種由杭州薦量獸用生物制品有限公司保存，EDS HI抗原及陽性血清購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.2 種蛋及試驗雞 發育良好的10日齡普通鴨胚作為制苗材料，種蛋EDS HI抗體不高于1∶4;SPF雞由北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司購進SPF種蛋，孵化后置實驗動物房隔離器內飼養。

1.1.3 主要儀器與試劑 Pellicon切向流超濾系統、膜Bioma×100面積為0.5 m2的標準膜堆均購自密理博中國有限公司。酪胨瓊脂(G.A)、硫乙醇酸鹽培養基(T.G)、葡萄糖蛋白胨湯(G.P)購自北京中海動物保健科技公司。

1.2 方法

1.2.1 雞減蛋綜合征病毒液的制備 選擇發育良好的10日齡易感鴨胚，取生產用種毒100倍稀釋，經尿囊腔接種，0.1 mL/胚。接種后密封針孔，置37.8℃下繼續孵育，不必翻蛋。鴨胚接種后，每日照蛋一次，將72 h前死亡的鴨胚棄去。此后，每4～6 h照蛋1次，死亡的胚隨時取出，直至120 h，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2～8℃冷卻24 h。將冷卻的鴨胚取出，無菌吸取尿囊液，若干個鴨胚分為一組，吸取尿囊液放于同一滅菌的容器內，每組抽樣測定血凝價，低于1∶10240(微量法)者棄去，將血凝價合格的尿囊液進行無菌檢驗。

1.2.2 病毒液的濃縮 先將病毒液用滅菌的100目/cm2的不銹鋼漏斗濾過，再用離心機3000～5000 r/min離心10 min，進行預過濾。然后將預過濾的盛有病毒液的容器通過無菌管道與超濾裝置連接，并反復循環通過超濾裝置，直至達到要求的濃縮終點。

1.2.3 病毒含量測定 將病毒液用滅菌生理鹽水10 倍系列稀釋，取 10－6、10－7、10－83 個稀釋度，接種已長成單層鴨胚成纖維細胞的96孔細胞培養板，每孔接種0.1 mL，每個稀釋度接種6孔，觀察120 h，記錄各孔的細胞病變情況，計算細胞半數感染量(TCID50)。

1.2.4 紅細胞凝集價 參照《中華人民共和國獸藥典》附錄中紅細胞凝集試驗(微量法)［3］進行測定。

1.2.5 滅活 濃縮后測定病毒含量合格的病毒液，按體積加入10%的甲醛溶液，至終濃度為0.1%(V/V)，充分振蕩均勻，37℃恒溫滅活16 h。滅活后逐瓶抽樣，進行滅活檢驗。

1.2.6 無菌檢驗 參照《中華人民共和國獸藥典》附錄中無菌檢驗方法［3］。

1.2.7 滅活檢驗 取10日齡易感鴨胚5枚，尿囊腔接種滅活后的鴨胚尿囊液，0.1 mL/枚，每日照蛋2次，連續觀察5 d。對所有胚液分別測定血凝價，無論是否出現血凝，均應盲傳1代，測定血凝性，均為陰性時，判定滅活完全。

1.2.8 疫苗制備 將滅活后的EDSV抗原液用滅菌生理鹽水進行 1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1∶256稀釋。參照《中華人民共和國獸用生物制品規程》中雞減蛋綜合征滅活疫苗制備方法［4］，制備不同抗原含量的滅活疫苗。

1.2.9 疫苗的性狀檢驗、無菌檢驗、安全檢驗及甲醛、汞類防腐劑殘留量測定 參照《中華人民共和國獸用生物制品規程》附錄［4］對各批疫苗進行性狀檢驗、無菌檢驗、安全檢驗及甲醛、汞類防腐劑殘留量測定。

1.2.10 動物分組免疫 將70只21日齡SPF雛雞隨機分為7組，10只/組。按照抗原含量1∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256 的稀釋倍數分免疫組和空白對照組。頸部皮下接種，0.5 mL/只。

1.2.11 HI抗體效價測定 免疫后21 d，每只雞分別翅靜脈采血，分離血清。參照《中華人民共和國獸藥典》附錄中血凝抑制試驗方法［3］，進行HI抗體效價測定。

2 結果與分析

2.1 制苗用病毒液的生產情況及濃縮前后的檢驗EDS病毒液經過Pellicon切向流超濾系統濃縮至6.5倍，濃縮前后的檢驗結果見表1。

表1 制苗用病毒液制備及濃縮前后檢驗情況匯總

2.2 制苗用病毒液的無菌檢驗及滅活檢驗結果EDSV滅活病毒液接種易感鴨胚盲傳1代，測定HA效價，所有樣品均呈HA陰性且胚胎發育正常，滅活檢驗合格，結果見表2。

表2 制苗用病毒液無菌及滅活檢驗結果

2.3 疫苗的性狀檢驗、無菌檢驗、安全檢驗及甲醛、汞類防腐劑殘留量測定 對各批疫苗進行了性狀檢驗、無菌檢驗、安全檢驗及甲醛、汞類防腐劑殘留量測定，結果完全能夠達到規程中的各項要求，結果見表3。

表3 成品檢驗結果

2.4 HI抗體效價測定 接種后21 d，每只雞分別采血，分離血清，進行HI抗體效價測定，結果見表4。

表4 免疫后各試驗組雞血清中HI抗體效價水平 log2

3 討論

EDSV具有較好的免疫原性，由其制備的雞減蛋綜合征滅活疫苗對抵抗強毒攻擊具有較高的保護率［5］。提高單位體積的抗原含量是聯苗生產的技術關鍵，而抗原濃縮是達到此目的的理想辦法［6－9］。多次雞減蛋綜合征病毒液濃縮試驗結果證明，本試驗選用的美國密理博公司的超濾濃縮裝置系統，對雞減蛋綜合征病毒液濃縮效果較好，使用方便。濃縮過程濾出廢棄液中無抗原成分濾出，沒有抗原成分損失。HA效價和病毒含量與濃縮倍數在一定程度上呈正相關［10］，通過對濃縮后病毒液HA效價和TCID50的控制，可以保證使用濃縮后的胚液配苗。

本試驗利用血凝抑制試驗方法，測定免疫雞第21天抗體效價水平，評價免疫后血清中的抗體水平。結果表明:隨著抗原含量的降低，HI抗體效價水平也下降，濃縮6.5倍的滅活抗原再稀釋256倍制備的雞減蛋綜合征滅活疫苗，雖然免疫雞抗體效價的幾何平均值達到質量標準要求，但是已有3/10不符合標準，且有4只免疫雞僅僅符合標準，因此在實際生產中不建議使用此濃度稀釋抗原配苗。研究表明:制備與雞減蛋綜合征相關的多聯滅活疫苗，雞減蛋綜合征病毒液可根據HA效價和病毒含量適當調整濃縮倍數，以便確保疫苗質量和節約生產成本。

［1］BW卡爾尼克.禽病學［M］.第9版.高 福，劉文軍，主譯.北京:北京農業大學出版社，1991.

［2］蔡寶祥.近年來我國新城疫免疫研究進展［J］.中國家禽，2008，30(20):4 －7.

［3］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二O一O年版［S］.

［4］中華人民共和國農業部.中華人民共和國獸用生物制品規程［M］.北京:中國農業科技出版社，2000.

［5］張再清，劉君俠，馬維卿，等.雞減蛋綜合征油乳劑滅活疫苗效力試驗和免疫抗體消長規律測定［J］.中國畜禽傳染病，1997，19(6):40 －41.

［6］高以恒，葉凌碧.膜分離技術基礎［M］.北京:科學出版社，1989:254－259.

［7］鄭世蘭，姜北宇，劉福致，等.用平板式超濾機濃縮雞新城疫及法氏囊病毒試驗效果觀察［J］.華北農學報，1999，14(2):139－144.

［8］王明俊.獸醫生物制品學［M］.北京:中國農業出版社，1997:149－153.

［9］姜北宇，劉月煥，景小冬，等.禽用疫苗病毒濃縮技術的研究［J］.華北農學報，2007，22(5):165 －171.

［10］阮武營，崔保安，李新生，等.新城疫病毒—減蛋綜合征病毒抗原液與抗原濃縮液的HA效價關系［J］.中國畜牧獸醫，2010，37(1):180 －181.