卵寄生真菌刀孢蠟蚧菌對煙草根結線蟲的生物防治

陳德鑫，許家來，曹君正，武 俠，林北森，孔凡玉*

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.山東煙草研究院，濟南 250101；3.青島農業大學農學與植物保護學院，青島 266109；4.廣西壯族自治區煙草公司百色市公司，廣西 百色 533000）

根結線蟲是當前我國主要的農作物病原線蟲之一[1]。根結線蟲作為煙草主要的病原線蟲，每年對世界煙草生產造成嚴重的經濟損失。迄今尚缺少抗根結線蟲的商品化作物品種，且與非寄主植物輪作的農業措施在煙草產區難以施行。采用化學殺線劑防治根結線蟲病，由于土壤殘留、環境破壞及吸食對人不安全等因素，有的化學殺線劑已經被禁用，有的即將被禁用。迄今為止生產上尚無安全有效的防治煙草根結線蟲病害措施，促使人們開始尋求更為安全有效的防治手段，生物防治是目前國內外研究和應用的熱點，也是根結線蟲可持續治理的理想途徑之一[2-3]。

刀孢蠟蚧菌 Lecanicillium psalliotae（syn Verticillium psalliotae）對根結線蟲的生物防治具有重要的應用潛力。該菌寄主范圍很廣，既能寄生根結線蟲卵和 2齡幼蟲[4-7]、胞囊類線蟲[4]和腐生線蟲[8]，也能寄生大豆銹病等多種病原真菌[9-11]及多種農業害蟲[12-15]，具有很大的生物防治應用潛力。目前未見該菌對煙草根結線蟲的生物防治潛力評價。

本研究通過該菌離體條件下對分離自煙草根結線蟲卵和雌蟲的寄生測定及對煙草根結線蟲病害的田間防效測定，探明該菌對煙草根結線蟲的生防潛力，為進一步開發和利用該菌奠定理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

刀孢蠟蚧菌 Lecanicillium psalliotae CGM CC5329（QNCSE0810）由青島農業大學線蟲研究室提供。

1.2 刀孢蠟蚧菌對根結線蟲卵、雌蟲的寄生及卵孵化抑制的測定

本試驗于2010年5月在青島農業大學線蟲學研究室進行，將采自云南被南方根結線蟲侵染的煙草病根洗凈，直接挑取新鮮的卵塊和健康雌蟲。用1%次氯酸鈉震蕩分離新鮮的卵塊，收集游離卵，制成每毫升 3000個卵的懸浮液。刀孢蠟蚧菌對煙草根結線蟲卵、雌蟲寄生及卵孵化抑制的測定試驗設計參見文獻[7]。

1.3 刀孢蠟蚧菌菌劑的制備

將干燥麥麩加入營養液（0.2% K2HPO4，0.1%KH2PO4，0.3% KNO3，0.001% FeSO4，0.03% NaCl，0.03% MgSO4·7H2O，0.3% Tryptone）并充分混勻，使麥麩濕度達70%后，裝入1000 mL三角瓶1/2處，121 ℃滅菌30 min 備用。挑取PDA平板上27 ℃、6 d的純培養物邊緣直徑6 mm菌塊，加入三角瓶中，每瓶放菌塊10個。27 ℃暗箱培養，每天搖瓶3次，使之充分發酵。7 d后取出自然晾干備用。

1.4 刀孢蠟蚧菌菌劑的田間防效測定試驗設計

試驗于 2010—2011年在山東諸城市、廣西百色市進行。諸城市相州鎮高戈莊村往年發生根結線蟲病較重的地塊，土壤為褐土，肥力中等；百色市隆林縣蛇場鄉大壩屯，根結線蟲病較重的地塊，土壤為紅壤土，肥力中等。供試品種為紅花大金元，是南方根結線蟲感病品種。

試驗共設5個處理水平，即施菌劑30、15、7.5、5、0 kg/667m2，0為CK。菌劑在烤煙移栽時一次全部施入。小區面積33 m2，每區50株，3次重復，完全隨機排列，處理間設保護行，按優化栽培管理煙草。采收期采用 5點取樣法，每點定株調查 25株，調查煙草根結線蟲病的病株率，并計算病情指數。采收期煙株拔根調查計算根結指數。根據病株率、根結指數計算相對防效，相對防效計算方法見文獻[16]。收獲期根結嚴重度的分級標準[17]為0級：無根結；1級：1/3以下根系上有少量根結；2級：1/3～1/2根系上有根結；3級：1/2以上根系上有根結，少量根結上再產生根結；4級：幾乎所有根系上長滿根結，甚至連結成根結團塊。計算公式[18]：

根結指數=∑（各級植株數×相應級值）／（調查總株數×最高級別代表值）×100

相對防效＝（對照根結指數－處理根結指數）／對照根結指數×100%

2 結 果

2.1 刀孢蠟蚧菌對南方根結線蟲卵的寄生

卵內充滿菌絲以及胚胎和1齡幼蟲被破壞的卵定義為被寄生的卵。培養5 d后寄生率為83.29%。被寄生的卵被菌絲穿透卵殼，在卵表面形成菌網，有的卵殼皺縮凹陷甚至破裂，內容物外滲（圖1A）；菌絲侵入卵內，在卵內生長，使卵內容物凝集，胚胎發育停止，卵殼變形，卵殼內充滿菌絲并產生鐮刀形分生孢子（圖1B）。未接菌的卵殼初期表面光滑，內容物均勻（圖1C），3 d后可見明顯的胚胎發育（圖1D），5 d后孵化出2齡幼蟲破殼而出。

2.2 刀孢蠟蚧菌對南方根結線蟲雌蟲的寄生

觀察接菌培養基上的年輕雌蟲，菌絲接觸雌蟲體壁形成致密菌網和侵染釘，穿透雌蟲體壁，體壁皺縮變形，內含物外滲（圖2B）。未接菌培養基上的雌蟲，外殼表面光滑，內含物均勻完整（圖2A）。

圖1 刀孢蠟蚧菌對南方根結線蟲卵的寄生過程Fig.1 Parasitic process of L.psalliotae to M.incognita eggs

圖2 刀孢蠟蚧菌對南方根結線蟲雌蟲的寄生Fig.2 Parasitism of L.psalliotae to the female of M.incognita

2.3 刀孢蠟蚧菌對卵孵化的抑制效果

未接菌的卵塊解離48 h后孵化率為78.8%。接菌的卵塊，解離后卵殼表面粗糙，卵質發黑，48 h后孵化率僅為5.7%，胚后發育期的卵表面粗糙，表明卵內幼蟲亦被寄生。刀孢蠟蚧菌對南方根結線蟲卵塊寄生后的卵孵化抑制率為92.77%。

2.4 刀孢蠟蚧菌對煙草根結線蟲的相對防效

試驗結果發現，當施用菌劑量為 30 kg/667m2時，有燒苗現象，植株長勢矮小，葉片泛黃，根系變褐腐爛，直至萎蔫死亡。由表1可以看出，其他處理均有一定的防效，當菌劑施用量為15 kg/667m2時防效最好，達80%以上，根系發達，根結少而小，有的很難找到根結（圖 3A、C）。對照組呈明顯雞爪狀，須根少，根結多而大（圖3B、D）。

2.5 刀孢蠟蚧菌對煙草長勢的影響

表1 不同處理根結線蟲根結指數及防效Table1 Effects of different treatments on root-knot index and relative control effect

從采收初期至采收完最后一片煙葉，隨機取煙葉測量葉面積，在采收最后一片煙葉后，各小區隨機取15 株測量其株高、莖圍和鮮質量。結果表明，除施用30 kg/667m2菌劑的處理外，其他處理在株高、葉面積指數、莖圍和鮮質量均優于對照，株高、葉面積指數、莖圍測量及計算方法參照文獻[19]。其中施用15 kg/667m2菌劑的處理最為明顯（表2、3）。

3 討 論

刀孢蠟蚧菌CGMCC5329對煙草根結線蟲卵和卵塊具有很強的寄生能力和孵化抑制作用，對卵的寄生率第5天為83.29%，與曹君正等[7]報道的寄生率相近，對卵塊的孵化抑制率為91.41%。這與Eapen等[20]報道的高效菌株蠟蚧菌Verticillium lecanii V1對卵塊的孵化抑制率相近。刀孢蠟蚧菌CGMCC5329對不同時期的卵均有侵染能力，但胚前發育期卵的寄生率明顯高于胚后發育期卵。線蟲的卵殼是防御土壤微生物侵入的有效屏障，主要由幾丁質（約占40%）和蛋白質構成[21]。這可能是在侵染過程中，產生幾丁質酶和蛋白酶分解卵殼[22]。

表2 不同處理對煙草長勢的影響（山東）Table2 Effects of different treatments on morphological indices of tobacco plants (Shandong)

表3 不同處理對煙草長勢的影響（廣西）Table3 Effects of different treatments on morphological indices of tobacco plants (Guangxi)

本試驗用麥麩作為菌劑發酵的主要培養基，在施用量為30 kg/667m2時，有明顯的燒苗現象，這可能與麥麩降解不充分且在土壤中的濃度過高，施入土壤后，通過自然降解產生大量氨氣等造成燒苗。試驗結果表明施用量為15 kg/667m2時，防治效果最好，且相對防效與長勢情況與楊有才等[23]和祝明亮等[24]報道的結果類似。

煙草根結線蟲的生物防治在資源普查、高效菌株篩選、生防菌劑的研制及田間試驗等方面前人已經做了大量研究工作[25]。但是，由于生防菌株在復雜土壤微生態環境的影響下，生防菌劑防效很難達到理想效果，本研究是在未考慮土壤環境等因素的前提下進行的，且取得了較為理想的效果，說明該菌株可以作為高效生防菌株進行更深入的研究。對于該菌株產生的幾丁質酶和蛋白酶活性及其與土壤微生態環境共存穩定性，需要做進一步研究，同時進一步評價溫室和大田中影響該菌定殖及發揮防效的關鍵生態因子，以便為該菌的開發利用提供理論依據。

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