離子色譜-積分脈沖安培法測定煙草中18種游離氨基酸

于宏曉，徐海濤，馬 強，呂 健，張 晉，岳 勇，趙曰利，肖協忠

（山東中煙工業有限責任公司技術中心，青島 266101）

煙草中的含氮化合物對煙草的感官評吸質量和吸者健康有重要的影響，歷來受到人們的普遍關注。氨基酸是煙草和煙氣的香味成分之一，也是煙草中一類重要的致香前體物質。氨基酸的含量與煙草的品質有著密切的關系，其含量的高低直接影響到煙草的味道和煙氣的豐滿度[1-2]。適量的氨基酸對形成優美的煙草香氣和吸味有重要貢獻。在煙草調制、醇化和加工直至燃燒過程中，游離氨基酸與還原糖之間可發生酶催化及非酶催化的棕色化反應，生成多種具有烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶類等雜環化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸還可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。因此，準確測定煙草中的游離氨基酸含量對于煙草加工過程中香味物質損失的控制與補償具有重要的意義。1958年，Moore和Stein等[3-5]首先提出了用陽離子交換色譜與柱后茚三酮衍生結合的方法分析蛋白質水解生成的氨基酸，實現了氨基酸分析的自動化。其后，氨基酸分析技術隨著衍生方法、柱載體化學和自動化技術發展而不斷提高。

近年來，人們越來越重視氨基酸分析方法的研究與改進，高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法是最近發展起來的無需柱前和柱后衍生的氨基酸直接分析方法，該方法具有快速、靈敏、準確的優點。本試驗優化了離子色譜-積分脈沖安培法檢測煙草中游離氨基酸方法，采用該方法成功檢測了煙草中18種游離氨基酸。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ICS3000多功能離子色譜儀（美國 Dionex公司），電子天平（梅特勒，瑞士），ZP-200振蕩器（江蘇太倉實驗設備廠），Milli-Q?型超純水系統（美國Millipore公司）。

17種氨基酸混合標準溶液（waters公司），色氨酸（＞99%，生化試劑，Sigma公司），無水醋酸鈉（＞99.9%，Dionex公司），50%（w/w）NaOH溶液（Fisher公司），28%～30%氨水（Merck公司），37%HCl（Merck公司）。其他試劑均為分析純。4 mL SCX固相萃取小柱（Alltech公司）。試驗用水均為電阻率18.2 M?·cm的超純水。

1.2 淋洗液配制

分離氨基酸的3種淋洗液（A：超純水，B：250 mmol/L NaOH，C：1 mol/L NaAc）為了避免NaOH溶液吸收空氣中CO2生成Na2CO3降低淋洗液的洗脫效率，應迅速移取13.1 mL 50%NaOH溶液用超純水稀釋至1 L，得到250 mmol/LNaOH淋洗液；稱取82.0 g固體NaAc，用超純水溶解并稀釋為1 L，得到1 mol/L NaAc淋洗液。試驗時應該在淋洗液上施加氮氣保護。

1.3 色譜條件

AminoPac PAl0陰離子交換柱，包括分析柱（250 mm×2 mm）和保護柱（50 mm×2 mm）。采用梯度洗脫方法（表 1），積分安培檢測電化學波形（表2）。柱溫為32 ℃，流速0.25 mL/min，進樣體積25 μL。18種氨基酸標準溶液分離色譜圖見圖1。

1.4 樣品處理和分析

煙葉中含有大量的糖類和色素等物質，這些物質會干擾煙葉中游離氨基酸定量分析，Jandik等[6]采用在線除糖的方法實現了樣品中氨基酸的測定。牟世芬和周政華分別采用 DVB強酸性陽離子交換樹脂[7]和國產 732型陽離子交換樹脂[8]離線除糖的方法測定了游離氨基酸。本研究采用商品化 SCX固相萃取小柱離線除去煙葉中的糖類和色素物質，取煙葉在40～50 ℃條件恒溫2 h，粉碎后過80目篩，篩下物為實驗用煙樣粉末。稱取煙樣粉末1.0 g，精確至0.001 g，置于50 mL錐形瓶中，加0.06 mol/L HCl溶液20 mL，振搖提取30 min，過濾，取濾液1 mL稀釋至10 mL，混合均勻，20000 r/min高速離心30 min，再取上清液1 mL通過SCX固相萃取小柱除去溶液中的干擾游離氨基酸定量分析的糖類和色素等物質，將從 SCX固相萃取小柱洗脫下來的氨基酸洗脫液在65 ℃水浴下氮氣吹干，2 mL 0.06 mol/L的HCl溶液定容，用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液作為待測溶液，過 SCX固相萃取小柱后煙葉提取液中18種游離氨基酸的色譜圖見圖2。

表1 分離18種游離氨基酸的淋洗梯度條件Table1 Gradient condition for analyzing 18 amino acids

表2 18種游離氨基酸的積分安培檢測電化學波形Table2 Detection waveform for 18 amino acids

圖1 8種游離氨基酸標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 18 standard amino acids

圖2 煙葉提取液中18種游離氨基酸的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 18 free amino acids in the tobacco extraction solution

2 結 果

2.1 線性范圍與回收率

該方法用于氨基酸的檢測，靈敏度高，檢出限在 0.03～0.75 μg/mL（25 μL 進樣），線性范圍較寬，達到2～3個數量級，相關系數在0.9900～0.9992，離線除去糖類和色素等干擾物質后，18種氨基酸的回收率都在80%～115%，因此該方法可用于煙草中18種游離氨基酸的分析檢測。

2.2 烤煙、白肋煙和香料煙不同類型單料煙中游離氨基酸的對比分析

對比烤煙、白肋煙和香料煙不同類型單料煙中游離氨基酸的含量（表3），這3種不同類型的單料煙中游離氨基酸的含量存在著很大差別，白肋煙的游離氨基酸的總量最高，同時白肋煙的精氨酸、賴氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、色氨酸的含量遠遠高于烤煙和香料煙的含量。烤煙的脯氨酸和蛋氨酸的含量高于白肋煙和香料煙的含量。香料煙的纈氨酸和酪氨酸的含量高于烤煙和白肋煙的含量。

表3 烤煙、白肋煙和香料煙中18種氨基酸的含量 mg/gTable3 The contents of 18 free amino acids in flue-cured tobacco, burley tobacco and oriental tobacco

2.3 國內外烤煙型和混合型卷煙中游離氨基酸對比分析

對比國內外烤煙型和混合型卷煙游離氨基酸的含量（表 4）看出，混合型卷煙的精氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸的含量明顯高于烤煙型卷煙的含量，同時混合型卷煙的總游離氨基酸的含量也明顯高于烤煙型卷煙的含量。主要是由于混合型卷煙配方中含有白肋煙，而白肋煙中精氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸的含量和游離氨基酸總量明顯高于烤煙。烤煙型卷煙的蛋氨酸和脯氨酸的含量明顯高于混合型卷煙的含量，是因為烤煙的脯氨酸和蛋氨酸的含量高于白肋煙的含量。國內外烤煙型和混合型卷煙游離氨基酸的差異性規律進一步佐證了烤煙和白肋煙游離氨基酸的差異性規律。

表4 國內外烤煙型和混合型卷煙18種游離氨基酸的含量 mg/gTable4 The contents of 18 free amino acids in flue-cured cigarettes and blended cigarettes

3 結 論

離子色譜-積分脈沖安培法具有快速、靈敏和準確的優點，與已有的其他分析煙草中游離氨基酸的方法相比，具有所需試劑簡單、無需柱前或柱后衍生的特點。利用該方法測定了不同類型單料煙和國內外不同風格卷煙中 18種游離氨基酸的含量。結果表明，白肋煙的游離氨基酸的總量最高，混合型卷煙的總游離氨基酸的含量明顯高于烤煙型卷煙的含量，其他游離氨基酸的含量隨著煙草的類型和風格的不同也存在著明顯的差異。

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[2]李丹，黃龍，朱巍，等.反相高效液相色譜法測定煙葉中的游離氨基酸[J].煙草科技，2003（2）：20-24.

[3]Moore S, Spackman D H, Stein W H.Chromatography of Amino Acids on Sulfonated Polystyrene Resins.An Improved System[J].Anal.Chem., 1958, 30(7):1185-1190.

[4]Spackman D H，Stein W H, Moore S.Automatic Recording Apparatus for Use in Chromatography of Amino Acids[J].Anal.Chem., 1958, 30(7): 1190-1206.

[5]Moore S, Stein W H.Chromatographic determination of amino acids by the use of automatic recording equipment[J].Methods Enzymol., 1958, 6: 819-831.

[6]Jandik P, Cheng J, Jenson D, et al.Simplified in-line sample preparation for amino acid analysis in carbohydrate containing samples[J].J.Chromatogr.B,2001, 758(2): 189-196.

[7]Ding Y S, Yu H, Mou S F.Off-line elimination of carbohydrates for amino acid analysis of samples with high carbohydrate content by ion-exchange chromatography [J].J.Chromatogr.A, 2003, 997(1/2):155-160.

[8]周政華，楊元，洪君蓉，等.固相萃取-離子色譜-積分脈沖安培法測定人血清中游離氨基酸[J].分析化學，2007，35（7）：1063-1066.