烤煙根系分泌物的分離鑒定及對種子萌發(fā)的影響

高欣欣，于會泳，張繼光，劉帥帥，時 鵬，王樹鍵，申國明*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院青島煙草資源與環(huán)境野外科學(xué)觀測試驗站，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

鑒于對我國農(nóng)田種植制度、土地流轉(zhuǎn)方式及經(jīng)濟效益等方面的考慮，煙草連作種植制度依然普遍，煙草連作對煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)以及煙草生長發(fā)育都具有嚴(yán)重的不良影響[1]，已成為制約我國煙草農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要障礙[2-3]。為了減輕煙草連作障礙，國內(nèi)外學(xué)者從土壤理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)、土壤病蟲害等多方面進行了大量研究[4-7]。有研究表明，煙草根系分泌物對煙草幼苗生長、根系養(yǎng)分吸收以及根系活力等都有抑制作用[8]，并能夠減少土壤中微生物種類和數(shù)量，破壞煙草生長的微生態(tài)環(huán)境[9]，但有關(guān)煙草根系分泌物具體化學(xué)成分的研究較少。本研究通過對烤煙根系分泌物中化學(xué)成分進行分析，為煙草根系分泌物的深入研究提供理論基礎(chǔ)，這對消除煙草連作障礙具有重要理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為山東煙區(qū)烤煙主栽品種中煙 100、NC89和K326。試驗于2010年12月至2011年5月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院青島煙草資源與環(huán)境野外科學(xué)觀測試驗站進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 幼苗砂培 用10%的鹽酸浸泡石英砂后，用水沖洗至無氯離子且pH穩(wěn)定為止，采用托盤育苗法進行常規(guī)育苗，幼苗大十字期時選擇生長一致的幼苗進行移栽。每天澆營養(yǎng)液200 mL；參試營養(yǎng)液組成如下：Ca(NO3)21.90 g/L；NH4H2PO40.24 g/L；Mg(SO4)·H2O 0.98 g/L；K2SO41.029 g/L；CaCl2，0.894 g/L；KNO31.22 g/L；H3BO31.90 g/L；MnCl2·4H2O 1.8 g/L；ZnSO4·H2O 0.22 g/L；CuSO4·5H2O 0.08 g/L；H2MoO4·4H2O 0.09 g/L；EDTA-Fe。

1.2.2 烤煙根系分泌物的收集提取 移栽后培養(yǎng)40 d，完整取出生長一致的煙株，分別放入一定量去離子水中培養(yǎng)（每24 h更換收集一次去離子水），連續(xù)收集 2 d。收集液過濾后用乙酸乙酯萃取。方法為：取定量過濾后的收集液用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相為中性組分；將剩余水相用1M HCl調(diào)節(jié)pH至2后，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相為酸性組分；將剩余水相再用1M NaOH調(diào)節(jié)pH為8，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相為堿性組分，將酸性、堿性和中性乙酸乙酯萃取液分別減壓濃縮至1 mL（45 ℃），過0.45 μm濾膜[10]。

1.2.3 根系分泌物的硅烷化處理 將乙酸乙酯萃取后的上述濃縮樣品中分別加入0.25 mL硅烷化試劑（BSTFA:TMC=5:1），加蓋密封后于 80 ℃水浴中衍生2 h，待測[11]。

1.2.4 GC-MS分析條件 硅烷化后的各組分根系分泌物采用Agilent7890A-5975C測定。采用電子轟擊源，轟擊電壓70eV，掃描范圍M/Z 30-600AMU，掃描速度0.2 s掃全程，離子源溫度230 ℃。毛細(xì)管柱：HP-5MS柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，柱溫50 ℃（2 min），以6 ℃/min程序升溫至250 ℃（保持15 min）。載氣為He，流量1 mL/min，進樣量為1 μL。應(yīng)用NiST08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，分析質(zhì)譜圖，確定各組分物質(zhì)名稱。

1.2.5 種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢測定 實驗 1：取中煙100根系分泌物進行3個組分萃取，方法同1.2.2，萃取后濃縮10倍，制成3個組分根系分泌物的乙酸乙酯濃縮液。準(zhǔn)確吸取各組分乙酸乙酯濃縮液10 mL，加入鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，待乙酸乙酯揮發(fā)后，加蒸餾水5 mL，對照先加10 mL乙酸乙酯，待揮發(fā)后加入5 mL蒸餾水。實驗2：將延胡索酸、丁二酸、煙堿3種物質(zhì)用去離子水溶解為不同濃度的溶液（延胡索酸：50、150、750、1000 mg/L；丁二酸：500、750、1000、2000 mg/L；煙堿：100、500、750、1000 mg/L），準(zhǔn)確吸取5 mL以上各濃度溶液加入鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中。每個培養(yǎng)皿中整齊排入100粒煙草種子，每個處理3個重復(fù)，在28 ℃、4000 Lux下的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，調(diào)查并計算種子的發(fā)芽勢（7 d）和發(fā)芽率（14 d）。

2 結(jié) 果

2.1 根系分泌物種類和含量差異

在不同提取條件下，3個品種共有的根系分泌物主要是有機酸類、甘油和煙堿（表1）。通過品種間兩兩比較分析可知，其共有成分大部分是有機酸類，例如苯甲酸、丁二酸、肉桂酸、肉豆蔻酸、軟脂酸、硬脂酸等。這說明不同品種烤煙根系分泌物中的主要成分是大分子有機酸。此外，3個品種的根系分泌物具有各自的特點，其中在中性提取條件下，中煙 100含量較高的根系分泌物有肉豆蔻酸（66.25%）、延胡索酸（11.45%）；K326含量較高的有丁二酸（27.90%）、2-羥基丙酸（15.87%）和軟脂酸（14.52%）；NC89含量較高的有東莨菪素（27.28%）、軟脂酸（16.08%）。在酸性提取條件下，中煙 100含量較高的根系分泌物有丁二酸（49.53%）、延胡索酸（12.29%）；K326含量較高的有軟脂酸（57.09%）；NC89含量較高的有2-羥基丙酸（24.34%）、丁二酸（16.41%）、軟脂酸（10.36%）。在堿性提取條件下，中煙100含量較高的根系分泌物有軟脂酸（20.85%），其次為硬脂酸（18.02%）；品種K326含量較高的有硬脂酸（23.85%），其次為軟脂酸（20.51%）；NC89含量較高的為棕櫚酰胺（30.24%）。

表1 各品種根系分泌物含量Table1 Root exudates contents of each variety

2.2 不同提取條件下根系分泌物對煙草種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響

2.2.1 發(fā)芽勢 由表2可以看出，與空白對照相比，根系分泌物的3種組分對煙草種子發(fā)芽勢均有不同程度的抑制作用，中性組分的抑制作用最強，與對照呈極顯著差異；酸性組分與對照呈顯著差異。但3個組分之間差異不顯著。不同組分對煙草種子發(fā)芽勢的抑制作用順序依次為：中性組分＞酸性組分＞堿性組分。

表2 中煙100各組分根系分泌物對煙草種子發(fā)芽勢的影響Table2 Effects of different components of exudates from Zhongyan100 on seminal germination viability

2.2.2 發(fā)芽率 從圖1可以看出，添加不同組分根系分泌物時的種子發(fā)芽率均低于空白對照，其中空白對照的發(fā)芽率為86%，添加中性組分后發(fā)芽率為47%，添加堿性組分為65%，酸性組分為50%。表明根系分泌物的3種組分對煙草種子發(fā)芽率均有抑制作用。不同組分對煙草種子發(fā)芽率的抑制作用大小順序依次為：中性組分＞酸性組分＞堿性組分?？梢詮膫?cè)面反映出酸中性條件下所提取的根系分丁二酸隨濃度增加對發(fā)芽勢的抑制作用呈現(xiàn)先增加后降低然后再增加的趨勢；延胡索酸在濃度達到300 mg/L時煙草種子發(fā)芽勢為65%，與空白對照相比降低了18%；丁二酸在濃度達到1000 mg/L時煙草種子發(fā)芽勢為65%，與對照相比降低了18%；煙堿含量為750 mg/L時煙草種子發(fā)芽勢為60%，與對照相比降低了24%。泌物中含有對煙草生長起主要抑制作用的物質(zhì)。

圖1 中煙100不同組分根系分泌物對煙草種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of different components of exudates from ZhongYan100 on seminal germination percentage

2.3 根系分泌物主要成分對煙草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響

2.3.1 發(fā)芽率 選取根系分泌物延胡索酸、丁二酸和煙堿進行煙草種子發(fā)芽率試驗（圖2），可以看出，添加3種物質(zhì)后，種子發(fā)芽率均低于對照（濃度為0的處理），表明此3種物質(zhì)對發(fā)芽率均有抑制作用，并且隨著其濃度的增加，發(fā)芽率逐漸降低，且降低趨勢逐漸變大；未添加外源物質(zhì)（濃度 0）處理的種子發(fā)芽率為82%，延胡索酸濃度300 mg/L時，發(fā)芽率為降為71%；丁二酸在濃度為1000 mg/L時發(fā)芽率降為77%；煙堿含量為750 mg/L時，煙草種子的發(fā)芽率為64%；均對煙草種子的發(fā)芽率有抑制作用。

2.3.2 發(fā)芽勢 由圖3可以看出，添加3種物質(zhì)后煙草種子發(fā)芽勢均降低。隨著延胡索酸和煙堿濃度的增加發(fā)芽率逐漸降低，降低趨勢逐漸變大；其中

3 討 論

通過對3種烤煙根系分泌物的種類和含量進行分析，得出烤煙根系分泌物主要包括2-甲基丙酸、丁二酸、延胡索酸、苯甲酸、月桂酸等有機酸，以及煙堿，新植二烯等煙草特有物質(zhì)和少量的酮類、醇類。這與吳天祥等[12]研究結(jié)果基本一致。并且通過對不同提取條件下根系分泌物對種子發(fā)芽率的影響，表明其抑制作用表現(xiàn)為中性組分＞酸性組分＞堿性組分，分析得到烤煙根系分泌物中的主要化學(xué)成分為丁二酸、苯甲酸、延胡索酸、軟脂酸和硬脂酸等，這與陳紹莉等[13]、侯永俠等[14]在茄子、辣椒根系分泌物中的研究結(jié)果一致，這主要與煙草和辣椒、茄子同屬為茄科作物有關(guān)。

本試驗選取3種煙草根系分泌物研究對煙草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響，結(jié)果表明，他們均對發(fā)芽勢和發(fā)芽率有影響，且隨著濃度的增加影響越明顯。對丁二酸的試驗結(jié)果與馬二培[15]的研究結(jié)果一致。另有研究表明，根系分泌物對大豆種子萌發(fā)及作物生長也具有一定的抑制作用[16-17]。

圖2 不同濃度延胡索酸、丁二酸、煙堿對煙草種子發(fā)芽率的影響Fig.2 Effects of different concentration of fumaric acid, succinic acid and nicotine on seminal germination percentage

圖3 不同濃度延胡索酸、丁二酸、煙堿對煙草種子發(fā)芽勢的影響Fig.3 Effects of different concentration of fumaric acid, succinic acid and nicotine on seminal germination viability

本試驗主要對生育前期（移栽后40 d）根系分泌物進行了調(diào)查，與中后期的分泌狀況存在差異，所使用的砂培培養(yǎng)，定期收集分泌物的方法在定性研究上具有先進性，但與大田生長環(huán)境也存在差異。為了進一步探索根系分泌物在土壤中的消長規(guī)律，揭示煙草連作障礙機理，減輕連作障礙，有必要對煙草根系分泌物與煙草的生長發(fā)育的關(guān)系進行更深入的研究。

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