腸胃清煎劑對裸鼠大腸癌皮下移植瘤奧沙利鉑治療的增效作用

金泉克 許建華 肖海娟 陸海 余文燕 王國娟 孫玨 范忠澤

大腸癌是世界各國惡性腫瘤中的主要死亡原因之一，在中國，大腸癌的死亡率位居癌癥死亡率的第4、5位[1]，而發(fā)達地區(qū)其死亡率已上升到各種惡性腫瘤中的第3位，上海則已居第二位[2]。奧沙利鉑是目前結腸癌的一線化療用藥,雖然奧沙利鉑對許多耐順鉑或卡鉑的腫瘤細胞仍抑制作用，并且在抗癌活性及毒副反應方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，但奧沙利鉑耐藥問題也成為影響臨床療效的一大難題[3]。筆者的前期研究表明，具有健脾化濕解毒功效的上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院制劑腸胃清方可明顯提高晚期胃腸道腫瘤患者以鉑類為基礎的化療的療效，明顯改善生存質量，延長中位生存期[4,5]。應用筆者所在的課題組建立的奧結腸癌耐藥細胞株HCT 116/L-OHP及其親本株HCT 116進行實驗，體外實驗研究表明，腸胃清藥物血清可通過影響DNA損傷修復途徑，提高奧沙利鉑抑制腫瘤細胞增殖的效果[6]。本研究在上述工作的基礎上，建立HCT 116及HCT 116/L-OHP結腸癌皮下移植瘤模型，進一步觀察中藥復方腸胃清煎劑對L-OHP抑瘤的增效作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系及實驗動物

人結腸癌細胞株HCT 116，購于南京凱基生物公司。HCT 116/L-OHP為本實驗室自行誘導，對L-OHP耐藥倍數(shù)達17.00倍。BALB/c裸小鼠80只，4～6周齡，體重(20±2)g，雌雄各半。購自于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[生產許可證號為SCXK (滬) 2003-0002]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院動物房SPF級動物實驗室[動物實驗室許可證號為SYXK (滬) 2005-0008]，自由飲食。

1.2 主要試劑及儀器

CELL 240型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(德國賀利氏公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；101-2干燥箱(上海市實驗儀器總廠)；95%乙醇(分析純)(上海振興化工廠)；奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；乙二醇雙乙胺醚-N，N’-四乙酸(EDTA)(Sigma公司)。

1.3 中藥制備

腸胃清煎劑：由生黃芪30 g、黨參15 g、生白術15 g、豬苓24 g、薏苡仁30 g、八月札24 g、野葡萄藤30 g、紅藤30 g組成。由上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院制劑室熬制成水煎劑，參照人與小鼠等效劑量換算公式，小鼠劑量約合25 g/kg，高劑量組為50 g/kg。煎煮方法：加水浸泡1小時，水煎2次，每次煎煮1.5小時，每次用水量為藥材的10倍量，水煎液過濾后濃縮至約150 ml，即為含生藥1.33 g/ml的水煎劑。

1.4 人結腸癌耐藥細胞株HCT 116/L-OHP的皮下移植瘤的建立

接種方法參考《細胞培養(yǎng)》[7]，取對數(shù)生長期HCT 116/L-OHP及HCT 116。將細胞消化后收集到離心管中，然后用磷酸緩沖液(PBS)制成濃度為1×107/ml的細胞懸液。取4～6周齡BALB/C裸鼠6只，體重(20±2)g，雌雄各半。常規(guī)消毒裸鼠右前肢的腋部皮下。按2×106個/0.2 ml的細胞數(shù)量，接種到裸小鼠的右前肢的腋部皮下，傳代14天后，自裸鼠身上剝離腫瘤組織，選取生長狀態(tài)良好，無破潰的腫瘤組織置于生理鹽水中，切成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊備用。在超凈臺中，裸鼠常規(guī)消毒，用20號套管針接種于裸小鼠背部右側近前肢皮下。本實驗所用腫瘤細胞株為第4代，異位瘤傳至第3代為模型。

1.5 L-OHP劑量的確定

最大耐受劑量(maximum tolerated dose，MTD)指動物能夠耐受的而不引起動物死亡的最高劑量。通過預實驗，確認本研究以裸小鼠對L-OHP 1/2 MTD為實驗劑量。參照文獻[8]報道，選擇健康裸小鼠15只，分設不同的劑量組(30、25、20、15、10 mg/kg)，每組3只動物，每周腹腔注射L-OHP 3次(星期一、三、五)，連續(xù)3周，最后確定本研究的MTD，1/2 MTD作為實驗劑量。實驗結果僅有10 mg/kg組裸鼠均存活，即本研究MTD量。故以5 mg/kg作為實驗劑量。見表1。

表1 荷瘤裸鼠L-OHP劑量確定

1.6 動物分組及藥物干預

參照《中藥新藥研制開發(fā)技術與方法》[9]。造模成功后，待HCT 116及HCT 116/L-OPH腫瘤生長至50～100 mm3左右，分別將50只裸鼠隨機分成5組，每組10只：對照組予以生理鹽水灌胃，0.4 ml/次，1天1次，每周5次，并予以生理鹽水腹腔注射，隔天1次，每周3次，共3周；腸胃清組，以50 g/kg的腸胃清煎劑予以灌胃，0.4 ml/次，1天1次，每周5次，并予以生理鹽水腹腔注射，同前，共3周；L-OPH組予以1/2 MTD L-OPH腹腔注射，隔天1次，每周3次，共3周，生理鹽水灌胃同前；腸胃清高、低劑量+L-OPH組，分別按50 g/kg和25 g/kg的腸胃清煎劑予以灌胃，0.4 ml/次，1天1次，每周5次，予以L-OPH 1/2 MTD腹腔注射，隔天1次，每周3次，共3周。

1.7 腫瘤體積的測量

以腫瘤體積的變化，反映藥物的療效。從開始給藥當天即用卡尺測量腫瘤大小，每周2次，腫瘤體積以公式〔π/6(w1×w2×w2)〕計算(w1為瘤塊最大徑，w2為最小徑)，根據(jù)測定結果描繪腫瘤生長曲線。并以此計算T/C%(T代表實驗組腫瘤體積，C代表對照組腫瘤體積)[10]。

1.8 荷瘤小鼠的體重

以體重的減輕反映治療的毒副作用。體重每周測定3次，直至末次治療后2周。體重的減輕用公式：開始體重-最輕體重/開始體重×100%計算[11]。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 腸胃清煎劑聯(lián)合化療藥物對皮下移植瘤瘤體抑制率

瘤體生長曲線表明，腸胃清煎劑及L-OHP均能在一定程度延緩皮下移植瘤的生長，腸胃清聯(lián)合化療藥物可顯著減緩腫瘤的生長，尤以腸胃清高劑量+L-OHP組瘤體生長最為緩慢，見圖1、3。腸胃清組、L-OHP組、腸胃清高、低劑量+L-OHP組對荷HCT 116移植瘤小鼠抑瘤率分別為84.48%、56.66%、53.75%、48.32%，以腸胃清煎劑聯(lián)合L-OHP組明顯，與對照組有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；對荷HCT 116/L-OHP移植瘤小鼠抑瘤率分別為74.87%、47.90%、43.52%、38.01%，與對照組有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；見圖2、4。同時聯(lián)合給藥對耐藥株皮下異位瘤的抑制率較敏感株增加，其抑制效果明顯，在有效治療劑量中，與腸胃清劑量存在量效關系，見圖1-4。

2.2 腸胃清煎劑聯(lián)合化療藥物對皮下移植瘤荷瘤體重的影響

圖1 腸胃清煎劑對HCT 116/L-OHP細胞系皮下移植瘤瘤體生長曲線

圖2 腸胃清煎劑對HCT116/L-OHP細胞系皮下移植瘤抑瘤率

圖3 腸胃清煎劑對HCT116細胞系皮下移植瘤瘤體生長曲線

圖4 腸胃清煎劑對HCT116細胞系皮下移植瘤抑瘤率

兩組移植瘤小鼠體重在治療后，敏感株異位瘤組：對照組體重減輕為2%，腸胃清組、L-OHP組、腸胃清高、低劑量+L-OPH組裸鼠體重減輕分別為5%、9.87%、7%、6.43%，同空白對照組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表2；耐藥細胞株異位瘤組：對照組體重減輕為2.20%，腸胃清組、L-OHP組、腸胃清高、低劑量+L-OPH組裸鼠體重減輕分別為4.29%、8.77%、3.21%、3.97%，以L-OHP組最為顯著，同空白對照組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，兩腸胃清煎劑聯(lián)合化療作用組荷瘤鼠體重減輕影響均少與化療組，同對照組比較沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)；同L-OHP組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表3。

表2 腸胃清煎劑對荷HCT116移植瘤小鼠體重變化

注：與對照組相比aP<0.05。

表3 腸胃清煎劑對荷HCT116/L-OHP移植瘤小鼠體重變化

注：與對照組相比aP<0.05，同L-OHP組比較bP<0.05。

3 討論

近年來中國結腸癌發(fā)病率逐漸升高，但臨床上腫瘤化療耐藥現(xiàn)象日益嚴重，影響了患者生存期的延長和生活質量的改善[12]。腫瘤的多藥耐藥性(MDR)是一個復雜的生物學過程，影響因素和參與機制眾多，這也是造成化療失敗的重要原因[13]。臨床和實驗研究表明，中醫(yī)藥聯(lián)合化療可提高化療的效果，其增效作用不僅表現(xiàn)在非鉑類化療的個體中，而且在以鉑類為基礎治療方案的肺癌、卵巢癌等腫瘤中也得到充分體現(xiàn)[14,15]。體內的增效作用，與增加腫瘤化療的敏感性密切相關，同時與減少腫瘤血管的生成、抑制癌細胞的侵襲轉移、調節(jié)機體的免疫功能等關聯(lián)。

大腸癌在中醫(yī)學中屬“積聚”、“腸風”、“下痢”、“臟毒”等范疇，其發(fā)病普遍認為涉及二方面因素：一為內因，為正氣不足；一是外因，為毒邪損傷腸絡，痰瘀凝聚腸道所致。腸胃清方是上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院博士生導師范忠澤教授的經驗方，主要由生黃芪、白術、豬苓、米仁、八月札、野葡萄藤等組成，具有益氣補脾、燥濕理氣解毒之功效。對病理確診的術后復發(fā)或未能手術的晚期胃癌、大腸癌患者，在化療方案的基礎上，加用具有健脾化濕解毒作用的中藥復方，與單純化療組對比，中藥復方加化療組生存質量明顯提高，中位生存期明顯延長[4,5]。

奧沙利鉑(L-OHP)是近年來被推薦的II、III期結直腸癌的一線治療藥物，是繼順鉑、卡鉑后推出的第三代鉑類抗癌藥，其特點是對耐順鉑、卡鉑細胞株均有顯著的抑制作用[16]。本實驗通過逐步增加作用于親代細胞HCT 116的L-OHP濃度與間斷大劑量L-OHP作用，建立耐藥細胞HCT 116/L-OHP[17]，采用皮下接種的方式建立結腸癌皮下異位瘤模型，觀察了腸胃清煎劑對L-OHP治療結腸癌耐藥細胞皮下移植瘤的增效作用。研究結果顯示，腸胃清煎劑聯(lián)合L-OHP組荷瘤小鼠體重減輕影響均少于化療組，尤其是對HCT 116/L-OHP耐藥細胞異位瘤裸鼠體重的減輕影響效果更為顯著，表明腸胃清煎劑可以減少L-OHP的毒副作用。同樣，腸胃清煎劑具有一定抑制腫瘤生長的能力，在聯(lián)合化療藥物作用下，其抑制效果明顯，以耐藥細胞異位瘤體更為顯著，表明腸胃清煎劑可以對L-OHP治療耐藥結腸癌具有增敏作用。而且，在有效治療劑量中，與腸胃清煎劑劑量存在量效關系。

隨著對腫瘤多藥耐藥機制研究的深入，逆轉耐藥治療已成為腫瘤治療的熱點之一，而耐藥機制的復雜性決定了理想的逆轉藥物應該具有多靶點效應。中藥復發(fā)的多靶點特性，在腫瘤治療中的作用引起了人們的廣泛關注，臨床實踐證明腸胃清煎劑具有良好的減毒增效作用，且體外研究已表明中藥逆轉耐藥的有效性。本研究亦表明，化療藥物聯(lián)合腸胃清煎劑后，其抑制裸鼠體內耐藥皮下移植瘤的作用明顯得到增強，其增效作用與增加瘤體內的藥物濃度有關，但其具體的作用機制目前尚不明確，有待進一步的研究。

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