PESV干預K562細胞PI3K/Akt信號通路凋亡調控的研究*

張 蕾 ，楊文華 ，于文俊，郝 征 ，張 佳

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193；2.天津中醫藥大學，天津 300193）

PESV干預K562細胞PI3K/Akt信號通路凋亡調控的研究*

張 蕾1，楊文華1，于文俊2，郝 征2，張 佳2

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193；2.天津中醫藥大學，天津 300193）

[目的]探討PESV對K562細胞PI3K/Akt信號蛋白及凋亡調控因子Bcl-2和Bad表達的影響。[方法]將體外培養K562細胞，經PESV處理不同時間后，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blot檢測PI3K及p-Akt蛋白水平變化，實時熒光定量RT-PCR檢測Bcl-2、BadmRNA水平變化。[結果]與對照組相比，PESV處理后K562細胞凋亡率顯著增加，PI3K及p-Akt表達降低，抗凋亡相關基因Bcl-2mRNA表達降低，促凋亡基因BadmRNA表達增加。[結論]PESV可能通過降低PI3K、Akt信號蛋白表達，調節Bcl-2和Bad表達，抑制K562細胞增殖，促進其凋亡。

PESV；K562 細胞系；凋亡；PI3K；Akt；Bcl-2；Bad

慢性粒細胞白血病（CML）簡稱“慢粒”，是起源于多功能造血干細胞的惡性增殖性疾病。Ph染色體自1960年在CML中被發現后，成為第一個被認識的與惡性疾病相關的細胞遺傳學改變。90%以上的慢粒患者中可發現有Ph染色體，即t（9；22）（q34；q11），形成BCR/ABL融合基因，BCR/ABL介導的Ph染色體畸變被認為是CML的始動突變[1]。BCR/ABL融合基因表達的編碼210 KD的BCR/ABL融合蛋白（p210）具有高度酪氨酸激酶活性，激活下游PI3K/Akt信號通路，并最終影響細胞核內調控凋亡和生存相關基因的表達，使多種癌基因表達異常,抑制白血病細胞的凋亡，最為常見的是B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）家族的信號分子，包括抑制細胞凋亡的因子（Bcl-2、Bcl-xl）和促進細胞凋亡的因子（Bad）等。筆者前期的研究證實蝎毒多肽提取物（PESV）在體內體外均能對白血病細胞有明顯的促進凋亡的作用[2-3]。本研究探討PESV對K562細胞的凋亡效應，以及對PI3K及p-Akt蛋白水平表達，及凋亡調控因子Bcl-2和Bad表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RPMI1640、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；Annexin V/PI雙染流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；PI3K、p-Akt一抗購自英國ABCAM公司；逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒及SYBR Green熒光染料MIX購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 藥物制備 PESV系將蝎毒粗毒應用分子篩層析技術提純所得，為分子量6 000～7 000的多肽混合物，純度為89.1%，使用前用生理鹽水溶解稀釋到所需濃度。

1.1.3 細胞系 人慢性粒細胞白血病細胞系K562細胞系有中國醫學科學院血液學研究所提供，用含10%FBS的RPMI1640培養液培養;均在37℃、5%CO2飽和濕度環境孵育。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 K562白血病細胞培養 K562白血病細胞用RPMI 1640完全培養液（含10%FBS），按常規方法培養。實驗時均取對數生長期細胞。

1.2.2 凋亡細胞檢測 收集對數生長期細胞，離心計數，調整細胞濃度為1.0×106/mL，接種于24孔培養板，每孔體積800μL。實驗組（A組）加入PESV 20μg/mL，陽性對照環磷酰胺（CTX）組（B組）加入CTX作用K562，空白對照生理鹽水組（C組）加入生理鹽水200μL。取24、48、72 h 3個時間點，各自取細胞離心5min，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2次，調節細胞濃度為5.0×105/mL，加入-20℃預冷70%乙醇2mL固定，RNase消化，4℃放置24h，PBS洗2次。每管加入PI，ANNEXIN-V雙染色，計數1×104個細胞，檢測細胞凋亡率，用FACSCan流式細胞儀檢測和分析凋亡細胞，同時以不加ANNEXIN-V及PI的一管作為陰性對照。

1.2.3 Western印記實驗 收集上述3組24、48、72 h 3個時間點K562細胞，離心計數，進行Western blot檢測。進行總蛋白提取，BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，按每泳道40mg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉印到PVDF膜上，用TBS-T（含 0.2%Tween20，5%脫脂奶粉）封閉 1 h；分別加入PI3K和Anti-phospho-AKT（Ser473）單克隆抗體，二抗，孵育，ECL顯影，凝膠成像系統拍照，應用Gel-Pro Analyzer 4.5軟件分析條帶灰度值，除以β-actin內參蛋白值以校正誤差，所得結果代表目的蛋白相對含量。

1.2.4 實時熒光定量RT-PCR 1）收集上述不同組3個時間點K562細胞，TRIZOL提取細胞總RNA,電泳鑒定RNA并定量，逆轉錄合成cDNA。2）實時熒光定量PCR反應：S YBR反應體系共20μL。反應條件為95℃ 5 min，95℃ 30秒，55℃30秒，40個循環，72℃20秒，設空白對照。各熒光曲線與基線交叉點的循環數即為 Ct值。根據 ΔC（t）=C（t）目的基因-C（t）β-actin，ΔΔC（t）=2-ΔC（t）計算目的基因與β-actin相對表達量。

表1 PCR擴增引物序列Tab.1 Primer sequenceof PCR

1.2.5 統計學方法 用SPSS 18.0統計軟件分析處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PESV對K562細胞凋亡的影響 K562細胞出現時間依賴的凋亡現象。白血病細胞經藥物處理24 h時，即可見到凋亡細胞上升，凋亡細胞百分比由3.63%上升到7.21%，并隨時間延長而繼續升高，至72 h時達到34.26%（P<0.05）。FCM定量顯示，PESV作用后隨時間的延長,凋亡細胞增多，在各時點，A組與B組及C組比較差異有統計學意義（P<0.05），見表2。與24 h處理組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。

表2 PESV對K 562細胞凋亡的影響（±s）Tab.2 Effectof PESV on apoptosisof K 562 cells（±s）%

表2 PESV對K 562細胞凋亡的影響（±s）Tab.2 Effectof PESV on apoptosisof K 562 cells（±s）%

注：與同時點的各空白組比較，*P<0.01；與同時點的CTX陽性對照組比較，△P<0.05。

組別 凋亡率24 h 48 h 72 h A 組 3.63±0.82*△ 7.21±1.69*△ 34.26±12.14*△B 組 2.26±0.48△□ 5.85±1.43△□ 22.17±9.340△□C 組 0.48±0.25△□ 1.36±0.64△□ 04.46±1.620△□

2.2 Western blot檢測 PESV對K562細胞PI3K和Anti-phospho-Akt（Ser473）蛋白的影響。各組蛋白印記清楚，PI3K分子量85KD，p-Akt分子量56KD，內參蛋白actin 43KD，內參條帶圖像清晰均一。A組K562細胞24、48、72 h PI3K蛋白含量在隨時間延長而減少，呈現明顯的時間依賴性；B組3個時間點PI3K蛋白含量在隨時間延長而減少，在24、72 h兩個時間點表達量均明顯高于A組（P<0.05）；C組K562細胞24、48、72 h PI3K蛋白含量在隨時間延長而逐漸增加，且3個時間點均高于A、B組（P<0.05），如表3。A 組K562細胞24、48、72 h p-Akt蛋白含量在隨時間延長而減少，呈現較明顯的時間依賴性；B組24 h p-Akt蛋白含量較高,在48、72 h兩個時間點表達降低，但仍明顯高于A組（P<0.05）；C組K562細胞24、48、72 h PI3K蛋白含量在3個時間點均高于 A、B 組（P<0.05），如圖 1。

表3 各組不同時間點蛋白相對表達量分析結果Tab.3 Resultsof the analysisof protein relative expression in each group at different time points

2.3 實時熒光定量RT-PCR法檢測PESV對K562細胞凋亡調節因子Bcl-2與BadmRNA的表達量的影響 PESV組應用熒光定量RT-PCR檢測K562細胞Bcl-2mRNA，其變異系數（CV）介于1.21%～8.65%之間，分布良好。CT值為28.51～31.193（中位30.07），24、48、72 h 相對含量 RQ 值平均值分別為1.205、0.769、0.740。各時間點與陽性對照組和空白對照組相比差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 各組K 562細胞Bcl-2m RNA表達情況Tab.2 Expression ofBcl-2mRNA in K 562 cellsineachgroup

PESV組應用熒光定量RT-PCR檢測K562細胞BadmRNA，其變異系數（CV）介于0.77%～7.24%之間，分布良好。CT 值為 24.712～28.92（中位 26.35），24、48、72 h相對含量RQ值平均值分別為2.015、3.443、6.934。各時間點與陽性對照組和空白對照組相比差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

圖3 各組K 562細胞BadmRNA表達情況Fig.3 Expression ofBadmRNA in K 562 cellsin each group

3 討論

根據其臨床表現慢性粒細胞白血病屬于“積聚”、“瘰疬”等范疇。其病機為風濕毒邪循經流注，風濕互結，閉阻脈絡，毒損絡脈之證，治以祛風除濕、解毒通絡。全蝎性味咸辛平、有毒，具有熄風祛濕、解毒通絡之功，為以毒治毒之要藥。全蝎的有效成分蝎毒多肽（PESV），本研究中發現PESV作用后K562細胞生長受到抑制，并且作用時間與抑制率間呈現明顯的依賴效應，與對照組比較差異有統計學意義。

90%以上的慢粒患者中可發現有Ph染色體，即t（9；22）（q34；q11），形成BCR/ABL融合基因[4]，BCR/ABL介導的Ph染色體畸變被認為是CML的始動突變。BCR/ABL融合基因中,主要由ABL段攜帶細胞惡變的主要信息，而BCR段的斷裂位點主要影響疾病表型[5]，不同的BCR/ABL融合基因類型與疾病表型相關[6-7]。PI3K/Akt信號通路作為細胞內重要信號轉導通路之一，通過影響下游通路，滅活caspase、誘導細胞周期素等相關基因轉錄或其轉錄調控子的生成及調控Bcl-2家族成員Bad、Bcl-2、及Bcl-xL表達的平衡等，在細胞內發揮著抑制凋亡、促進增殖的關鍵作用，與人類多種腫瘤的發生、發展密切相關[8-9]。

PI3K激活的Akt可以通過磷酸化作用，進一步激活或抑制其下游靶蛋白 Bad、caspase9、NF-κB等，而介導胰島素、多種生長因子等誘發的細胞生長，經多種途徑促進細胞存活，是重要的抗凋亡調節因子[10-11]。凋亡前體蛋白Bad是第一個被發現的由Akt靶向作用，并與凋亡有關的蛋白，是Akt的下游因子。Bad是Bcl-2家族成員之一，分布于線粒體外膜在細胞凋亡的調控上發揮重要作用[12]。當Akt未活化時，Bad可與Bcl-2形成復合體而表現促凋亡活性[13]。活化的Akt磷酸化Bcl-2家族中的Bad Ser136位點，引起Bad與伴侶蛋白（Chaperone）14-3-3結合，從而阻斷Bad與Bcl-2形成二聚體,使Bad不能發揮促細胞凋亡作用，而游離的抗凋亡因子Bcl-2發揮抗凋亡作用[14]。

在本研究中發現PESV能顯著降低K562細胞的PI3K，p-Akt的表達，有一定的時間依賴性。兩個蛋白的表達隨PESV作用時間的延長下調更為明顯，與其誘導凋亡的效應相一致，其效應均優于環磷酰胺。說明PESV較好的抑制了PI3K/Akt信號轉導途徑及該通路作用的下游通路，從而通過影響調控因子促進K562細胞的凋亡。同時本研究證實，PESV在通過抑制BCR/ABL酪氨酸激酶活性進而誘導K562細胞凋亡過程中對抗凋亡蛋白Bcl-2表達有下調作用，且呈時間依賴性，同時伴有促凋亡蛋白Bax的表達升高，導致抗凋亡和促凋亡因素的比例下降，使細胞走向凋亡。

慢性粒細胞白血病的發病機制提示筆者通過研制新的酪氨酸激酶抑制因子，抑制蛋白酶體或通過作用于BCR/ABL下游的靶向信號途徑[15]，對慢性粒細胞白血病的治療可能是一個新的有效的途徑，也為治療慢粒尋找基因靶向治療藥物提供了思路。本研究在一定程度闡明中藥全蝎提取物PESV促進慢性粒細胞白血病細胞的凋亡，干預PI3K、p-Akt信號蛋白表達，進而起到調控下游信號因子Bcl-2與Bad的表達，起到促進人慢性粒細胞白血病細胞K562細胞凋亡的作用。

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Study on PI3K/Aktmessenger passage and apoptosis controlling in PESV-preconditioned K 562 cells

ZHANGLei1,YANGWen-hua1,YUWen-jun2,HAOZheng2,ZHANG Jia2
（1.The FirstHospital Affiliated of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,Chin a）

[Objective]To investigate the effectof PESV on the expression ofmassage protein PI3K/Akt,apoptosis regulators Bcl-2 and Bad expression in K562 cells.[Methods]In vitro cultured K562 cells preconditioned with PESV for different timeswere determined for cellapoptosis ratewith cytoflowmeter,the level of PI3K and p-AKT protein with Western blotand Bcl-2,Bad mRNA level by realtime fluorescence quantitative RT-PCR.[Results]Compared with the controlgroup,the apoptosis rate of PESV treated K562 cellswas significantly increaseds,the expression of PI3K and p-Aktand anti-apoptosis-related gene Bcl-2mRNA was decreased;the expression of proapoptotic gene BadmRNAwas increased.[Conclusion]PESVmay regulate the expression of Bcl-2 and Bad,inhibit the proliferation of K562 cellsand promote theirapoptosisby reducing the expression of PI3K and Aktsignaling protein.

PESV;K562 cell lines;apoptosis;PI3K;Akt;Bcl-2;Bad

R733.72

A

1672-1519（2012）03-0274-04

教育部博士點基金項目（20091210110004）。

張 蕾（1978-），女，碩士，主治醫師，研究方向為中西醫結合血液病臨床和科研。

楊文華。

2012-02-28）