貴州黃壤地區葛藤根際溶磷細菌溶磷、分泌IAA及其它特性研究

李顯剛，姚 拓，王小利，舒健虹，陸瑞霞

（1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070；2.貴州省草業研究所，貴州 貴陽 550006）

近年來，如何有效解決我國土壤普遍缺磷，提高土壤磷的循環利用效率成為磷研究方面的熱點。利用微生物提高土壤中難溶性磷的生物有效性，對于促進作物增產和環境保護具有重要意義［1－4］，其中植物根際磷細菌與土壤中無機磷的轉化、貯藏及供應關系密切，在改善土壤供磷性能和結構方面作用顯著［5］。因此，新型溶磷微生物肥料的開發利用潛力巨大。

葛藤（Pueraria lobata）為多年生草質藤本植物，適應性強、耐寒、抗旱，其根、莖、葉、花等都含有豐富的營養，根瘤發達，固氮多，是發展現代農牧業的理想植物。葛藤的莖、枝、葉含有粗蛋白質20.89%～29.20%、粗脂肪2.45%～4.20%、粗纖維26.55%～34.189%、灰分5.91%～9.97%、鈣2.11%、磷0.09%和無氮浸出物30.39%～40.70%；同時莖、枝、葉中干物質含量為鮮草重量的22.30%，其中總能量17.53～18.62MJ/kg、消化能11.51MJ/kg、可消化粗蛋白質209g/kg［6］。目前，葛藤的藥用、飼用及生態等方面的開發利用價值正在提升，獲得了巨大的經濟效益、社會效益和生態效益［7］。近年來，溶磷細菌的研究多集中在部分牧草、農作物及土壤中［8－10］，對于藤本類飼料植物研究報道較少。此次對生長于貴州黃壤地區的葛藤根際溶磷菌進行分離，并根據不同菌株的溶磷強度、分泌IAA能力、產酸產堿性能及碳源利用特性篩選優良菌種，為開發利用葛藤根際溶磷微生物資源，提高喀斯特地區黃壤中磷素的循環利用率提供基礎材料，同時為葛藤的綠色無公害生產提供磷素營養奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

以5點法采集生長于貴州南部黃壤中（貴州省草業研究所試驗地）的葛藤根系及根際土壤樣品5份，每份樣品重0.5～1.0kg，采樣時間為2010年10月；采樣地土壤pH 5.97，有機質1.695%，全氮0.218%，水解氮156.98mg/kg，有效磷15.02mg/kg，速效鉀為10.20mg/kg。

1.2 溶磷細菌篩選

1.2.1 培養基 分離溶磷菌培養基（PKO）［11］：葡萄糖10.0g、NaCl 0.2g、（NH4）2SO40.5g、MgSO4·7H2O 0.1g、KCl 0.2g、MnSO40.03g、FeSO4·7H2O 0.003g、酵母粉0.5g、瓊脂15.0～20.0g、加蒸餾水至1 000mL、pH 6.8～7.2，含磷酸鈣3.0g，有改進。保存用LB培養基。

1.2.2 溶磷圈法篩選溶磷細菌 按常規分離細菌法［12］涂布樣品懸液于含難溶性磷酸鈣的PKO無機磷固體培養基平板上，28℃倒置于恒溫培養箱中培養至有類似溶磷菌的分離物后，挑取分離物進行純化，再點接種于含難溶性磷酸鈣的PKO固體培養基上進行溶磷菌株篩選［13］。

1.3 溶磷強度測定

采用鉬銻抗比色法測定有效磷含量。接種0.5 mL活化菌株菌懸液裝入50mL滅菌的無機磷培養基，28℃、150r/min恒溫搖床上振蕩培養7d。然后取培養液在10 000r/min轉速下離心10min，取適量上清液測磷含量，菌株溶磷量為培養液磷含量減去對照磷含量（以P mg/L表示），酸度計測定培養液pH值。每菌株重復3次，對照不接菌。

1.4 溶磷細菌分泌IAA能力測定

接種0.5mL菌懸液于裝有滅菌30mL King液體培養基，同1.3條件震蕩培養離心后，取菌株懸浮液1mL滴置于檢測板上，加入等量S2比色液，同時在比色液中分別加50μg/mL、30μg/mL、10μg/mL的標準植物生長激素（IAA）1mL作梯度對照，15min內室溫下觀察其顏色變化，確定菌株是否分泌IAA［14］。分泌IAA的菌株取上清液1mL加S2比色液1mL在黑暗中靜置30min后，用紫外分光光度計（530nm）測定吸光度，參照標準曲線計算菌株分泌IAA量（單位：mg/L）。S2比色液：氯化鐵4.5g，10.8moL/L濃硫酸1 000mL。

1.5 菌株產酸產堿性能測定

接種分離到的菌株純培養物于盛有已滅菌30mL NFM液體培養基的三角瓶中，每一菌株3個重復。三角瓶置于28℃恒溫搖床上，于125r/min培養72h，觀察并記錄培養基顏色變化。菌懸液顏色不變色（草綠色或綠色）則為中性菌株；變成黃色，表明其為產酸菌株；變成藍色為產堿菌株。同時，利用pH酸度計測定菌株懸浮液的pH值，以驗證菌株懸液的酸堿性。

1.6 菌株碳源利用特性測定

在LB培養基中分別以甘露醇、蔗糖、1/2甘露醇＋1/2蔗糖、木糖、麥芽糖、葡萄糖取代蛋白胨，制成不同碳源培養基。用接種環挑取適量菌株純培養物，以平板劃線法將其分別接種于不同碳源培養基上，置于28℃的培養箱中培養48h。觀察并記錄菌株菌落生長情況。

實驗數據采用Excel和SPSS16.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 溶磷菌株及其菌落特征

經溶磷圈法篩選，從葛藤根際土壤樣品共篩選出8株溶解磷酸鈣較強的溶磷細菌。HD（溶磷圈直徑）/CD（菌落直徑）值及菌落特征見表1。菌株在LB培養基上的菌落特征多乳白色、不透明、半濕潤扁平，均不產生色素。8株溶磷細菌在含難溶磷酸鈣的無機磷平板上生長10d時 HD/CD值均在2.0以上，其中GTR2產生的溶磷圈最大，菌落最小，HD/CD比值高達6.73，說明GTR2可能具有較強溶磷能力。但多數菌株HD/CD比值在2.1～2.5。培養過程觀察發現，多數菌株菌落在1～2d清晰可見，菌株在培養前2d時，透明圈增長快，但不會隨培養時間的延長而變大。

2.2 不同菌株溶磷強度

一般地，準確描述溶磷菌溶磷效果的方法是將菌株接種于液體培養基中振蕩培養7～10d測定培養液可溶性磷含量［15］。供試菌株經7d的振蕩培養后，葛藤根際溶磷菌溶解難溶性磷酸鈣的能力有所差異（表2），有效磷含量72.28～159.15mg/L，GTR12、GTR15及GTR2與其余菌株間有效磷含量差異達極顯著（P＜0.01）。其中GTR2菌株有效磷含量高達159.15mg/L，溶解磷酸鈣能力最強；GTR12、GTR15及GTR4次之。GTR5溶解磷酸鈣能力最差，有效磷含量僅為72.28mg/L。不同菌株溶磷能力為GTR2＞GTR12＞GTR15＞GTR4＞GTR11＞GTR6＞GTR3＞GTR5。研究發現，菌株培養液pH值與對照pH值7.0相比均有所下降，其中pH值最低的為3.06（GTR2），最高的為5.46（GTR3和GTR6）。

2.3 不同菌株分泌IAA能力

8株葛藤根際溶磷菌分泌IAA能力定性的顯色反應結果表明（表2），多數溶磷菌在具有溶解難溶性磷的同時還具有分泌生長素的功能。其中僅有GTR12無顏色反應，不分泌IAA；GTR15、GTR2、GTR3菌株的顯色反應為粉紅色，可能具有較強的分泌IAA的能力；菌株GTR5、GTR6、GTR4及GTR11顯色反應呈淺粉紅色，分泌IAA能力可能較弱。溶磷菌分泌IAA能力的定量測定與定性測定結果具有相對一致性，即GTR15和GTR2顯粉紅色，分泌IAA量分別為14.44 mg/L和12.71mg/L，均顯著高于其余菌株（P＜0.01）。GTR11分泌IAA量最小，為1.25mg/L。

表1 不同菌株HD/CD值及菌落特征Table 1 Colonial characteristics and HD/CD value of different phosphate solubilizing bacteria

表2 不同菌株溶解無機磷及分泌IAA能力Table 2 The ability of different strains for inorganic phosphorus solubilizing and IAA producing

2.4 不同菌株產酸產堿性能

8株溶磷菌株中6株為產堿菌株，占供試菌株的75.00%，菌株培養液顏色為藍色，pH 值在7.12～7.97。有2株為中性菌株，即GTR3和GTR12，pH值分別為7.02和7.05，菌株培養液顏色為原培養基顏色（綠色）。供試菌株中沒有產酸菌株（表3）。

表3 不同菌株產酸產堿性能Table 3 Acid or alkaline producer of different strains

2.5 不同菌株碳源利用特性

供試菌株幾乎都能在以甘露醇、蔗糖、1/2甘露醇＋1/2蔗糖、葡萄糖、木糖、麥芽糖為碳源的培養基上良好生長（表4）。其中除GTR5、GTR2、GTR11分別在含甘露醇、蔗糖及1/2甘露醇＋1/2蔗糖、麥芽糖碳源培養基上生長較好外，在其余供試碳源培養基上都能茂盛生長，這可能與各菌株本身特性、對不同碳源利用的差異性及碳源自身性狀有關。

表4 不同菌株碳源利用情況Table 4 Features of different strains for utilizing different carbon sources

3 討論與結論

3.1 討論

葛藤獨特的生態、飼用及藥用價值，越來越受到研究者及投資者的關注。據報道，土壤中能夠溶解難溶磷酸鹽的微生物比例較高，極端情況下高達70%～80%［16］。從貴州黃壤地區葛藤根系及根際土壤中分離獲得8株具有較強溶解磷酸鈣能力的溶磷細菌，表明葛藤根際中存在大量利用潛力大，且可能具促生、非致病性的溶磷類微生物。供試溶磷菌的HD/CD值在2.14～6.73，多數菌株 HD/CD值高于林啟美等［17］測得假單胞菌屬培養7d時的 HD/CD值（1.00～3.50），這可能與菌株本身溶磷特點有關［18］。液體振蕩培養下溶解磷酸鈣的量為72.28～159.15mg/L，與陶濤等［19］從水稻根際分離測得幾株溶磷菌的溶磷量102.77～174.08mg/L相當，低于李鵬等［20］從珠芽蓼分離的溶磷內生細菌溶磷量（902.14mg/L），說明不同植物根系及根際土壤中的溶磷細菌對磷酸鈣的溶解能力大小各異。此外，有研究表明，不同菌株溶解磷酸鈣能力差異較大［21］的原因可能與菌株種類、根際環境及溶磷機理不同有關，同時，植物根際溶磷菌的溶磷量還可能受土壤物理結構、土壤類型及土壤肥力、土壤耕作方式、前茬植物和有機質含量不同等因素影響［22，23］。如各菌株懸液pH值均較對照下降，一方面可能是培養液中Ca－P的存在對pH值變化的緩沖作用逐漸消失所致，另一方面可能是菌株分泌某些酸性物質，致使培養液pH值下降，難溶性磷酸鈣溶解。諸如溶磷菌的其他溶磷機理，如菌株在發酵過程中是否產生磷酸酶與溶磷能力大小有關等因素目前尚在試驗中。

許多研究表明，存在于植物根際的微生物同時具有多種功能［24］。如眾多禾本科及豆科牧草根際聯合固氮菌、根瘤菌和溶磷菌具有分泌IAA的能力，分泌的IAA容易在植物根毛區被吸收利用，從而促進植物生長［25］，韓文星等［26］在研究溶磷接種劑對燕麥生長和品質的試驗中，得到在含有溶磷菌（同時能分泌IAA）的各處理，燕麥株高、生物量、根長及粗蛋白含量等均顯著高于對照。此試驗中僅菌株GTR12未分泌IAA，其余溶磷細菌均具分泌IAA能力，如將這些菌株作為接種劑施用，可能會提高葛藤發達的根瘤菌固氮性能及根際磷素的利用率。此外，已有報道稱，水稻植株中的內生成團腸桿菌YS19能分泌生長素、細胞脫落酸、赤霉素和細胞分裂素，其中細胞分裂素有3種，即異戊烯腺嘌呤、玉米素核苷和二氫玉米素核苷［27］，鑒于此，作物根際細菌中包括IAA等多種激素產生的普遍性，有利于細菌第2代產物（如鐵載體）產生、分子氮的固定、對土傳病原物的拮抗和難溶磷酸鹽的溶解等，這些對確定根際微生物擁有一個或更多的PGPR特性至關重要。實驗將在后期對菌株產生IAA的途徑及是否分泌赤霉素等其他激素類物質、對植物的促生效應作深入探討與研究。

3.2 結論

菌株GTR2和GTR15具有較高溶磷和分泌IAA能力，同時碳源利用范圍廣，有望作為高效溶磷接種劑的菌種資源。

［1］ 馮瑞章，馮月紅，姚拓，等.春小麥和苜蓿根際溶磷菌篩選及其溶磷能力測定［J］.甘肅農業大學學報，2005，40（5）：604－608.

［2］ Wang G H.Solubilization of rock phosphate in liquid culture by fungal isolates from rhizosphere soil［J］.Pedosphere，2005，15（4）：532－538.

［3］ Gothwal R K，Nigam，V K，Mohanl，M K，et al.Phosphate solubilization by rhizospheric bacterial isolates from economically important desert plants［J］.Indian Journal of Microbiology，2006，46（4）：355－361.

［4］ 馮宏，李永濤，張志紅，等.類蘆根際溶磷真菌的篩選、鑒定及其溶磷能力分析［J］.微生物學通報，2010，37（5）：677－681.

［5］ 田宏，李鳳霞，張德罡，等.草坪草溶磷菌篩選及溶磷能力的初步研究［J］.草業科學，2005，22（10）：92－96.

［6］ 劉建林，夏明忠，羅 強，等.葛藤的飼用價值及其在攀西地區畜牧業中的應用［J］.資源開發，2005，21（1）：52－53.

［7］ 王民迪.葛藤的開發和利用［J］.中小企業管理與科技，2009，21：267.

［8］ 蔡磊，李文鵬，張克勤.高效解磷菌株的分離、篩選及其對小麥苗期生長的促進作用研究［J］.土壤通報，2002，33（1）：44－46.

［9］ Souchie E L，Abboud A C D.Phosphate solubilization by microorganisms from the rhizosphere of Pigeonpea genotypes grown in different soil classes［J］.Semina－Ciencias Agrarias，2007，28（1）：11－18.

［10］ 陳俊，陸俊錕，康麗華，等.紅樹林溶磷菌的初步鑒定、溶磷能力測定及其優化培養［J］.微生物學通報，2009，36（8）：1183－1188.

［11］ 齊文娟，龍瑞軍，周萬海，等.溶磷菌在5種不同培養基中溶解磷礦粉的性能比較［J］.草原與草坪，2007（5）：37－41.

［12］ Hafeez F Y，Malik K A.Manual on biofertilizer technology［K］.NIBG：Pakistan，2000.

［13］ 朱穎，姚拓，李玉娥，等.紅三葉根際溶磷菌分離及其溶磷機制初探［J］.草地學報，2009，17（2）：259－263.

［14］ 席琳喬，張虎，姚拓，等.聯合固氮菌固氮、分泌激素和溶磷能力的測定及對燕麥的促生效應［J］.草原與草坪，2005（3）：23－27.

［15］ 楊慧，范丙全，龔明波，等.一株新的溶磷草生歐文氏菌的分離、鑒定及其溶磷效果的初步研究［J］.微生物學報，2008，48（1）：51－56.

［16］ 田宏，姚拓，張德罡.蘭州地區草坪草根際溶磷菌分離及溶磷能力初步測定［J］.草原與草坪，2004（4）：39－41.

［17］ 林啟美，趙小蓉，孫焱鑫，等.四種不同生態環境土壤中解磷細菌的數量及種群分布［J］.土壤與環境，2000，9（1）：34－37.

［18］ 李鳳霞，張德罡，姚拓.高寒地區燕麥根際高效PGPR菌培養條件研究［J］.甘肅農業大學學報，2004，39（3）：316－320.

［19］ 陶濤，葉明，劉冬，等.無機解磷細菌的篩選、鑒定及其溶磷能力研究［J］.合肥工業大學學報，2011（2）：305－307.

［20］ 李鵬，陳秀蓉，李振東，等.珠芽蓼溶磷內生細菌Z14的鑒定［J］.甘肅農業大學學報，2009（6）：85－87.

［21］ Molla M A Z，Chow dhury A A.Microbial mineralization of organic phosphate in soil［J］.Plant and Soil，1984，78：393－399.

［22］ 范丙全，金繼運，葛誠.溶解草酸青霉菌篩選及其溶磷效果的初步研究［J］.中國農業科學，2002，35（5）：525－530.

［23］ Kucey R M N，Janzen H H，Legett M E.Microbially mediated increases in plant－available phosphorus［J］.Adv Agron，1989，42：199－228.

［24］ Gibson A H.Genetic variation in the effectiveness of nodulation of Lucerne varieties［J］.Aust J Agic Res，1962，13：388－399.

［25］ 姚拓.高寒地區燕麥根際聯合固氮菌研究Ⅱ.固氮菌的溶磷性和分泌植物生長素特性測定［J］.草業學報，2004，13（3）：85－90.

［26］ 韓文星，姚拓，席琳喬，等.PGPR菌肥制作及其對燕麥生長和品質影響的研究［J］.草業學報，2008，17（2）：75－84.

［27］ 沈德龍，馮永君，宋未.成團腸桿菌的生物功能多樣性及其分類最新進展［J］.微生物學雜志，2002，22（1）：40－42.