HPLC測定小兒七星茶沖劑中槲皮素含量

李 冬 劉志剛

HPLC測定小兒七星茶沖劑中槲皮素含量

李 冬 劉志剛

目的建立小兒七星茶沖劑中槲皮素的測定方法。方法采用HPLC法測定小兒七星茶沖劑中槲皮素的含量。迪馬C-18柱（4.6×250mm，5μm），以甲醇-0.4%磷酸（50:50，PH3.0）為流動相，柱溫為室溫，流速為1mL?min-1，檢測波長為360nm。結(jié)果槲皮素在0.009024μg～0.054144μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系（r2=0.9998，n=6），平均回收率為93.91%(RSD=0.91%)。結(jié)論該測定方法精密度高，重現(xiàn)性好，可用于小兒七星茶沖劑的質(zhì)量控制。

小兒七星茶沖劑；槲皮素；HPLC

小兒七星茶沖劑收載于部頒標(biāo)準(zhǔn)（WS3-B-1689-94）中，由山楂、稻芽、薏苡仁、淡竹葉、鉤藤、蟬蛻、甘草等七味藥材制成，各藥材之間搭配合理，相輔相成，山楂和稻芽為君藥治療主癥，薏苡仁和淡竹葉為臣藥直接加強(qiáng)君藥治療主癥的作用，甘草為使藥調(diào)和諸藥，更安全更全面對抗幼兒體內(nèi)的各種“火源”。小兒七星茶沖劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不足之處為未收載含量測定項(xiàng)，因此存在一定欠缺。本研究的主要目的是建立小兒七星茶沖劑穩(wěn)定的含量測定方法。本研究曾對處方中甘草的成分甘草苷[1]、山楂的成分熊果酸等物質(zhì)進(jìn)行了的含量測定研究，測定甘草中的甘草苷時，由于陰性供試品溶液始終存在雜質(zhì)干擾，分離度不易達(dá)到要求；制劑中熊果酸含量很低，不易測得，與肖樹雄[2]等的研究結(jié)果一致。因此本文重點(diǎn)討論測定山楂中得槲皮素含量測定。

山楂為方中君藥之一，具有消食健胃、活血化瘀、收斂止痢之功效。山楂主要含有黃酮類物質(zhì)、有機(jī)酸如綠原酸、咖啡酸及鞣質(zhì)、鞣酐、表兒茶酚、齊墩果酸、熊果酸等成分。槲皮素是山楂黃酮類物質(zhì)的代表性成分，具有較強(qiáng)的生理活性，有文獻(xiàn)報道該成分具有較好的祛痰止咳、抗血栓及抗氧化作用[3]。很多研究者以槲皮素作為山楂藥材及含有山楂中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制的含測指標(biāo)[4-5]，因此本研究采用HPLC法測定小兒七星茶沖劑中槲皮素的含量，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法具有重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確、分析快速、靈敏度高，且制得的樣品溶液穩(wěn)定性高，可用于小兒七星茶沖劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀（2487型DAD檢測器），迪馬C-18柱（250×4.6mm，5μm）；BP211D電子天平（德國賽托利斯）。小兒七星茶沖劑（市售）；槲皮素對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號：10081-200406）；乙腈（色譜純）；水為重蒸水，其它實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以甲醇-0.4%磷酸（50:50，PH3.0）為流動相，流速為1.0ml?min-1；色譜柱：迪馬C-18（250×4.6mm，5μm）；檢測波長為360nm。取供試品溶液10μl注入液相色譜儀測試，供試品溶液中槲皮素可與其他物質(zhì)基線分離，槲皮素的保留時間約為 15.2min，且陰性對照供試液在相同時間無色譜峰。理論塔板數(shù)以槲皮素計不低于4000。

圖3 陰性對照溶液HPLC色譜圖

2.2溶液的制備①對照品溶液：精密稱取槲皮素對照品適量，置量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1ml中含2.5μg的溶液，搖勻，濾過，即得。②供試品溶液：取本品適量，研細(xì)，取細(xì)粉約2g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加 30ml鹽酸甲醇溶液（取甲醇與25%鹽酸，按體積比4:1混合，搖勻），置水浴中回流 30min，取出，立即冷至室溫，轉(zhuǎn)移至 50ml量瓶，用甲醇洗滌燒瓶，洗滌液與樣品溶液混合，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。③空白對照溶液：按處方稱取缺山楂的各味藥材，照小兒七星茶沖劑生產(chǎn)工藝制備缺山楂空白對照顆粒，取缺山楂空白對照顆粒適量，照供試品溶液項(xiàng)下自“研細(xì)，取細(xì)粉約 2g”，同法操作，制備缺山楂空白對照溶液。

2.3線性關(guān)系考察稱取槲皮素對照品適量，精密稱定為11.28mg，置50ml量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，取1.0ml置25ml量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1ml中含9.024μg的溶液，搖勻，0.2μm微孔濾膜濾過，即得（濃度為9.024μg?ml-1）。分別精密吸取槲皮素對照品溶液 1、2、3、4、5、6ml，置10ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.2μm微孔濾膜濾過，得系列對照品溶液。分別精密吸取系列對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，以槲皮素峰面積（A）為縱坐標(biāo)，槲皮素進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)線性回歸得回歸方程為：Y=3958035.7X－1783.9，r2=0.9998（n=6），結(jié)果表明槲皮素進(jìn)樣量在0.009024μg～0.054144μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4專屬性試驗(yàn)分別吸取空白對照溶液、供試品溶液、對照品溶液（080421）各10μl，注入液相儀，記錄色譜圖，見圖1～3，結(jié)果表明空白對照溶液對小兒七星茶沖劑中槲皮素測定無干擾。

2.5精密度試驗(yàn)精密吸取 2.2項(xiàng)下供試品溶液（080421）10μl，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣 6次，以峰面積A計算RSD=2.15%，表明本實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取本品同一批號樣品（080421）6份，按供試品溶液的制備方法和色譜條件進(jìn)行測定，外標(biāo)法計算，槲皮素平均含量為0.05397mg/g，RSD＝3.34%，結(jié)果表明本方法具有較好的重現(xiàn)性。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取 2.2項(xiàng)下供試品溶液（080421）10μl，分別在 0、1、2、3、4、5、6h進(jìn)樣，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積A計算RSD=2.15%，說明樣品溶液中的槲皮素在6h內(nèi)穩(wěn)定，可滿足測定的需要。

2.8加樣回收率試驗(yàn)取已知槲皮素含量的小兒七星茶沖劑（槲皮素平均含量為 0.05397mg/g）0.75g，精密稱定，共計6份，分別精密加入槲皮素對照品儲備液（每1ml中含槲皮素0.0344mg）1.0ml，加鹽酸甲醇溶液25ml，按正文含量測定項(xiàng)下方法測定，槲皮素平均加樣回收率為93.91%，RSD=0.91%，結(jié)果顯示本測定方法具有較好的加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9樣品含量測定取小兒七星茶沖劑（080421、080513、080517），按2.2①項(xiàng)下對照品溶液制備方法制備對照品溶液，按2.2②項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μl，記錄峰面積，外標(biāo)法計算槲皮素的含量，結(jié)果見表2。

表1 槲皮素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

有學(xué)者對小兒七星茶沖劑或糖漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做了有益的探索，如肖樹雄[2]等測定了制劑中甘草酸銨的含量，曾常青[6]、李亞萍[7]等測定了制劑中鉤藤堿的含量。筆者認(rèn)為，測定制劑中鉤藤堿時，不僅存在環(huán)境污染問題，且樣品前處理需采用有機(jī)試劑進(jìn)行5次以上液液萃取，操作步驟復(fù)雜。另外鉤藤堿穩(wěn)定性較差，在極性條件下易異構(gòu)化和酯鍵受熱易分解，故需要控制整個前處理過程的溫度、pH等條件，不利于方法的推廣。而測定小兒七星茶沖劑中的槲皮素含量，操作步驟簡單，供試品溶液穩(wěn)定性好，對指標(biāo)成分的損失非常少，適宜推廣應(yīng)用。本研究色譜條件參考《中國藥典》2010年版一部銀杏葉項(xiàng)下含量測定方法[8]，槲皮素的 tR 約為15.2min，陰性對照溶液對槲皮素的測定無干擾。

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Content Mensuration of Quercetin in Xiao’er Qixingcha Chongji by HPLC

Li Dong Liu Zhigang

ObjectiveTo establish the determination of Quercetin in Xiao’ er Qixingcha Chongji.MethodsThe determination was carried out by HPLC with a KromasilC-18 column (250mm×4.6mm,5μm),Methanol -0.4% Orthophosphoric acid (50∶50) severed as the mobile phase,the speed was 1mL/min and the detection wavelength was at 360nm.ResultsQuercetin showed a good linear relationship at the range of 0.009024μg～0.054144μg (r2=0.9998,n=6); The average recovery of Liquiritin was 93.91% (RSD=0.91%).ConclusionThe method is sensitive,accurate,reproducible,specific and can be used for quality control of Xiao’er Qixingcha Chongji efficiently.

Xiao’ er Qixingcha Chongji;Quercetin;HPLC

廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510010

李冬(1989-)，女，廣東揭陽人，學(xué)士，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥學(xué)部藥師，主要從事中藥化學(xué)、分析學(xué)研究。