聚合物納米微球分離純化染料木素的工藝條件優化

劉晶芝，姜 雨

(1.河北師范大學旅游學院，河北 石家莊 050031；2.國家食品藥品監督管理局保健食品審評中心，北京 100061)

大豆異黃酮(Soybean isoflavones)是存在于大豆中的一類重要的生物活性物質，大豆異黃酮苷元主要包括大豆素(Daidzein)、染料木素(Genistein)和黃豆素(Glycitein)等，其中活性最強的為染料木素。染料木素結構與雌二醇類似，能夠與雌激素受體結合，發揮雌激素作用，此外，還具有抗腫瘤、抗氧化、抗骨質疏松等作用[1～3]。國內外已批準多種含染料木素的異黃酮產品作為食品用于人群。

目前，染料木素的分離純化方法主要有三種：一是直接從不含大豆素和黃豆素的植物(如槐角、木豆根莖)中提取，但由于植物中染料木素含量低使得工藝復雜、成本高；二是利用微生物發酵生產染料木素，存在發酵周期長、純度低等問題；三是從染料木素含量較高的大豆異黃酮苷元混合物中分離，但由于大豆素和黃豆素的結構與其類似，分離比較困難。文獻報道從大豆中分離高純度染料木素的方法有硅膠法、高速逆流色譜法等，存在反復上柱、操作繁瑣或處理量小等問題[4，5]。

作者在此采用聚合物納米微球對大豆異黃酮苷元混合物直接進行層析分離，并對聚合物納米微球型號、洗脫液體積分數、洗脫速度、載樣量等工藝條件進行了優化。

1 實驗

1.1 試藥、試劑與儀器

80％大豆異黃酮苷元混合物(含28％染料木素)，市售；染料木素對照品(編號111704)，中國藥品生物制品檢定所；聚合物納米微球，蘇州納微科技公司；乙腈，色譜純，Merck公司。

中壓層析系統，瑞士Büchi公司；中壓層析柱(15 mm×230 mm和26 mm×460 mm)；高效液相色譜儀(515泵，996檢測器)，Waters公司。

1.2 HPLC色譜條件

色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫為室溫；流動相為乙腈-0.5％ TFA(35∶65)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長260 nm；進樣量10 μL。

稱取染料木素對照品5 mg用甲醇溶解，配制成約500 μg·mL-1的標準儲備液；取一定量的標準儲備液用甲醇梯度稀釋，進行色譜分析，測定染料木素的色譜峰面積，染料木素在濃度為5～500 μg·mL-1時與峰面積有良好線性關系。

1.3 方法

用0.1 mol·L-1的NaOH溶液浸泡聚合物納米微球2 h，水洗至中性；然后用0.05 mol·L-1的HCl溶液浸泡2 h，水洗至中性；濕法裝柱。將大豆異黃酮苷元混合物用甲醇溶解后注入中壓層析柱頂端，用乙醇洗脫，分管收集，計算層析收率。合并純度大于98％(HPLC面積歸一法)的洗脫液，減壓濃縮至基本無乙醇，8 ℃放置2 h，過濾，水洗濾餅，真空干燥，得到染料木素粉末。

固定其它條件不變，分別考察聚合物納米微球型號、洗脫液體積分數、洗脫速度、載樣量(樣品與填料的質量體積比，g∶mL，下同)對分離純化效果的影響，以確定最優的分離純化條件。

2 結果與討論

2.1 聚合物納米微球分離純化染料木素的工藝條件優化

2.1.1 聚合物納米微球型號的確定

分別用型號為PS25-300、NM-MM100、PSA30-300的聚合物納米微球40 mL裝柱，將0.2 g大豆異黃酮苷元混合物用甲醇溶解后注入層析柱頂端，用60％(體積分數，下同)乙醇洗脫，洗脫速度為2 BV·h-1，每管收集5 mL，HPLC檢測，合并純度大于98％的染料木素洗脫液，計算層析收率，結果見圖1。

圖1 聚合物納米微球型號對層析收率的影響

由圖1可看出，PS25-300型聚合物納米微球對染料木素的分離效果最好，層析收率最高。故選擇PS25-300型聚合物納米微球作為染料木素的層析介質。

2.1.2 洗脫液體積分數的確定

將0.2 g大豆異黃酮苷元混合物用甲醇溶解后注入PS25-300聚合物納米微球層析柱頂端，分別用體積分數為50％、60％、70％、80％的乙醇洗脫，洗脫速度2 BV·h-1，HPLC檢測，合并純度大于98％的染料木素洗脫液，計算層析收率，結果見圖2。

圖2 乙醇體積分數對層析收率的影響

由圖2可看出，乙醇體積分數大于60％時，由于洗脫體積小，洗脫速度過快，染料木素和其它大豆苷元一起被洗脫，分離效果不好；當乙醇體積分數小于60％時，由于洗脫體積過大且拖尾現象嚴重，分離效果也不好；當乙醇體積分數為60％時，染料木素的分離效果最好，洗脫速度適中，層析收率高。故選擇洗脫液乙醇的體積分數為60％。

2.1.3 洗脫速度的確定

將0.2 g大豆異黃酮苷元混合物用甲醇溶解后注入PS25-300聚合物納米微球層析柱頂端，以60％的乙醇作為洗脫液，分別采用0.5 BV·h-1、1 BV·h-1、2 BV·h-1、4 BV·h-1、6 BV·h-1的洗脫速度進行洗脫，HPLC檢測，合并純度大于98％的染料木素洗脫液，計算層析收率，結果見圖3。

圖3 洗脫速度對層析收率的影響

由圖3可看出，洗脫速度過慢，易擴散，染料木素層析收率偏低；洗脫速度過快，洗脫不集中，染料木素與其它大豆苷元得不到有效分離，高純度染料木素的層析收率也不高；洗脫速度為2 BV·h-1時，高純度染料木素的層析收率最高。故選擇洗脫速度為2 BV·h-1。

2.1.4 載樣量的確定

分別按照1∶400、1∶300、1∶200、1∶100、1∶50的載樣量上樣，用60％乙醇洗脫，洗脫速度2 BV·h-1，HPLC檢測，合并純度大于98％的染料木素洗脫液，計算層析收率，結果見圖4。

圖4 載樣量對層析收率的影響

由圖4可看出，在保證分離效果的前提下，隨著染料木素載樣量的增加，染料木素的層析收率逐漸降低；當載樣量超過1∶200時，染料木素與其它苷元得不到有效分離，層析收率顯著下降(<50％)；載樣量在1∶400～1∶200時，層析收率較穩定。考慮到成本因素，選擇載樣量為1∶200。

2.2 工藝驗證

在確定的最優條件下，即以PS25-300型聚合物納米微球為分離介質、洗脫液乙醇體積分數為60％、洗脫速度為2 BV·h-1、載樣量為1∶200(g∶mL)，在240 mL層析柱(26 mm×460 mm)上進行了3批驗證實驗，所得染料木素的HPLC圖譜見圖5。

由圖5結果計算可知，PS25-300型聚合物納米微球對大豆異黃酮苷元中的染料木素有很好的分離純化效果，平均層析收率大于75％、純度大于98％。

3 結論

以PS25-300型聚合物納米微球為分離介質，將大豆異黃酮苷元用甲醇溶解后進行層析分離，用60％乙醇洗脫，洗脫速度控制在2 BV·h-1，載樣量為1∶200(g∶mL)，此時，層析收率大于75％、純度大于98％。該工藝過程簡單、易操作、產品收率高、質量可控，可用于高純度染料木素的分離純化。

圖5 染料木素的HPLC圖譜

參考文獻：

[1] Guo J M，Xiao B X，Liu D H，et al.Biphasic effect of daidzein on cell growth of human colon cancer cells[J].Food Chem Toxicol,2004,42(10):1641-1646.

[2] Arjmandi B H，Smith B J.Soy isoflavones′ osteoprotective role in postmenopausal women:Mechanism of action[J].J Nutr Biochem，2002,13(3)：130-137.

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[5] Du Q Z，Li Z H，Ito Y.Preparative separation of isoflavone components in soybeans using high-speed counter-current chromatography[J].J Chromatogr A，2001,923(1-2):271-274.