響應面法優化Aspergillus oryzae Cs007產酯水解酶發酵條件

劉虹才,鄢洪德,徐 瑋,汪 釗

(浙江工業大學生物與環境工程學院,浙江 杭州 310014)

酯水解酶(Ester hydrolase)，是一類極其重要的生物催化劑，可水解酯類物質產生相應的酸和醇，在日用化學品、食品、醫藥、制革、紡織等行業應用極其廣泛[1]；也可以在有機相中催化可逆的合成反應，如酯化、轉酯化、酯交換等，其催化作用具有化學選擇性、區域選擇性和立體選擇性[2,3]。

米曲霉(Aspergillusoryzae)是絲狀真菌中普遍存在的種屬，具有表達多種酶蛋白的能力，如蛋白酶、淀粉酶、酯酶、纖維素酶等，且不產生黃曲霉素等毒性物質，是公認為對人體安全的菌株，廣泛應用于食品、飼料、釀酒等發酵工業。米曲霉還具有分泌蛋白質及產胞外酶的能力，其發酵性能優良，因此又成為具有商業潛力的基因工程表達系統[4,5]。實驗室篩選到一株產酯水解酶的米曲霉菌株WZ007，是既產胞內酶又產胞外酶的典型菌株，其所產的酶在酯化拆分生物素中間體內酯和硫辛酸時表現出良好的光學選擇性[6,7]，但酶活力較低，所需反應時間長，不利于工業化應用。為了提高其產酶活力，采用γ-射線對米曲霉WZ007進行誘變，獲得一株誘變效果較好的突變株米曲霉Cs007。

響應面法(RSM)是一類簡易、迅速、可靠的統計學優化方法，在微生物培養基組成和培養條件的優化工作中發揮著極其重要的作用[8]。比起傳統的優化方法如逐因子實驗和部分因子實驗，響應面法能快速有效地分析各因素的主效應及交互效應，在一定水平范圍內求得最佳值。

作者在此利用響應面法結合單因子實驗來優化米曲霉Cs007的發酵產酶條件，以進一步提高其產酶活力，為其應用創造條件。

1 實驗

1.1 菌種、試劑和培養基

AspergillusoryzaeCs007為實驗室保藏菌種，經500Gy137Csγ-射線輻照(劑量為1.3 μSv·h-1)誘變篩選獲得。其原始菌種為AspergillusoryzaeWZ007，由實驗室篩選得到，保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC No.M206105)。

對硝基苯酚乙酸酯(pNPA)，Alfa公司；橄欖油、蛋白胨、酵母膏、蔗糖、阿拉伯膠等生化試劑為進口或國產分析純。

斜面培養基(質量濃度，％)：馬鈴薯 20，蔗糖 2，瓊脂 2，pH值自然。

發酵培養基(質量濃度，％)：蛋白胨 1，KH2PO40.15，MgSO40.05，NaCl 0.05，橄欖油1(體積分數)，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

將米曲霉Cs007在斜面培養基上于30 ℃培養4 d。用無菌水將斜面上的孢子洗下，制成1×106個·mL-1的孢子懸浮液。按10％(體積分數)接種量接至50 mL/250 mL 三角瓶液體發酵培養基中，30 ℃、200 r·min-1下培養48 h。將培養液于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清液測定發酵液酶活力。

1.2.2 酶活測定方法

酯水解酶活力的測定以pNPA為底物，參照Gao等[9]的測定方法并進行改進。將0.1 mL 30 mmol·L-1pNPA的乙腈溶液和2.8 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖溶液(pH值 7.5)混合后，于40 ℃恒溫水浴保溫5 min；加入適量酶液，反應5 min后立即加入1 mL無水乙醇終止反應，在405 nm下測定吸光度。以滅活的酶液作對照。

酶活力單位定義：每分鐘催化產生1 μmol對硝基苯酚所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.2.3 實驗設計

首先通過單因子實驗確定米曲霉Cs007產酶發酵培養基的主要組分；再采用SAS 9.0軟件進行Plackett-Burman設計篩選影響米曲霉Cs007產酶發酵的顯著因素，然后根據實驗擬合的一次多項式確定最速上升方向，通過最陡爬坡實驗和Box-Behnken中心組合實驗進行進一步優化，實驗結果用二次多項式回歸擬合，用微分計算預測最佳點，并對擬合方程作顯著性檢驗及方差分析，采用響應面法分析確定顯著因素的最優水平；最后通過單因子實驗確定最佳搖床轉速和培養時間。

2 結果與討論

2.1 單因子實驗篩選最佳碳源、最佳氮源及最佳表面活性劑

2.1.1 碳源對米曲霉Cs007產酯水解酶的影響

分別以1％的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、三油酸甘油酯、橄欖油、大豆油、玉米油作為培養基的碳源，考察不同碳源對米曲霉Cs007發酵產酶的影響，結果見圖1。

圖1 不同碳源對產酶的影響

由圖1可看出，培養基中碳源的種類對產酯水解酶的影響很大，以碳水化合物作碳源時，胞外酶活力很低，其中以可溶性淀粉作碳源的酯水解酶活力最低，僅0.04 U·mL-1，由此可見，米曲霉Cs007對碳水化合物的利用能力很弱，可能碳水化合物對該酯水解酶的產生有一定的抑制作用；而以甘油或油脂作碳源時，產酶效果明顯，這與Hoshino等[10]所報道的其它米曲霉菌種利用碳源情況相似，其中橄欖油作碳源的酯水解酶活力最高，達2.8 U·mL-1，因此，選擇橄欖油為發酵產酶的最佳碳源。

2.1.2 氮源對米曲霉Cs007產酯水解酶的影響

以1％的橄欖油為培養基的碳源，分別添加1％(質量濃度，下同)的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、豆餅粉、玉米粉、硫酸銨、氯化銨為氮源，考察不同氮源對米曲霉Cs007發酵產酶的影響，結果見圖2。

圖2 不同氮源對產酶的影響

由圖2可看出，米曲霉Cs007對氮源的利用有極大的選擇性，無機氮源不利于菌體生長，幾乎不產酶；有機氮源有利于菌體生長，其中以蛋白胨為氮源時，產酶效果最明顯，這與王小花等[11]的研究結果相似。因此，選擇蛋白胨為發酵產酶的最佳氮源。

2.1.3 表面活性劑對米曲霉Cs007產酯水解酶的影響

表面活性劑能提高橄欖油在水中的可溶性，對產酶有著重要的影響。在培養基中分別添加濃度為0.2％(質量濃度，下同)的吐溫-20、吐溫-80、Triton X-100、阿拉伯膠和聚乙烯醇，考察不同表面活性劑對米曲霉Cs007發酵產酶的影響(以不加表面活性劑的培養基作為對照)，結果見圖3。

圖3 不同表面活性劑對產酶的影響

由圖3可看出，Triton X-100和阿拉伯膠可明顯促進產酶，其中阿拉伯膠的效果更好。因此，選擇阿拉伯膠為產酶培養基的表面活性劑。

2.2 Plackett-Burman實驗設計及結果分析

根據單因子的優化結果，通過SAS 9.0軟件進行Plackett-Burman設計(n=12)：實驗設計橄欖油(X1)、蛋白胨(X2)、MgSO4(X3)、KH2PO4(X4)、起始pH值(X5)、阿拉伯膠(X6)、溫度(X7)等7個因素，另設一個虛擬項(X8)，每個因素各取高(+1)、低(-1)兩個水平，響應值Y為發酵所產酯水解酶酶活。實驗設計和結果見表1，各因素水平及效應評價見表2。

表1 Plackett-Burman實驗設計及結果

表2 Plackett-Burman設計的各因素水平及效應評價(α=0.05，置信度95％)

由表2可知，在7個影響產酶因素中，對產酶的影響顯著且置信度在95％以上的因素為：蛋白胨>KH2PO4>阿拉伯膠>溫度>橄欖油。選擇蛋白胨、KH2PO4和阿拉伯膠這3個因素作為進一步研究對象。其中蛋白胨和阿拉伯膠對產酶呈現正效應，KH2PO4則呈現較大的負效應，要提高產酶能力，應適當提高蛋白胨、阿拉伯膠的濃度，降低KH2PO4的濃度。其它因素根據其效應的正負，分別固定在較好水平上，即橄欖油和MgSO4的濃度分別為1％、0.05％(質量濃度，下同)，起始pH值為5，培養溫度為30 ℃。

2.3 最陡爬坡實驗確定主要因素的水平中心點

根據Plackett-Burman實驗結果，對蛋白胨、KH2PO4和阿拉伯膠3個因素進行最陡爬坡實驗。根據各自效應的大小，設定蛋白胨(X2)、KH2PO4(X4)和阿拉伯膠(X6)增長的方向和步長依次為+0.1、-0.01、+0.05，最陡爬坡實驗設計及結果見表3。

表3 最陡爬坡實驗設計及其結果

由表3可知，最大產酶區在4#實驗附近，故以4#實驗的條件為水平中心點，進行響應面實驗設計。

2.4 響應面法優化顯著因子水平

2.4.1 Box-Behnken實驗設計及結果

采用Box-Behnken中心組合設計，以酯水解酶酶活為響應值設計了3因素3水平共15個實驗點的響應面實驗，其中設3個零點，零點實驗進行3次，以估計誤差。Box-Behnken實驗的因素和水平見表4，結果見表5。

表4 Box-Behnken實驗因素與水平

表5 Box-Behnken響應面實驗設計及結果

2.4.2 二次回歸擬合及方差分析

根據表5的實驗結果，用SAS 9.0進行二次回歸擬合，得到酯水解酶酶活(Y，U·mL-1)與影響產酶的顯著因素(自變量，X)的函數關系式為：

Y=6.483333-0.2925X2-0.15875X4-0.16375X6

對回歸分析的結果進行方差分析，見表6。

表6 方差分析

由表6可知，該方程的各因子與響應值之間的關系顯著，回歸方程的一次項、平方項都高度顯著，交互項不顯著。在α=0.05水平上，該模型失擬項不顯著，回歸高度顯著。由置信度分析可得該模型決定系數R2為97.43％，表明97.43％的酶活變化可由該模型分析，回歸擬合度較好。該方程為米曲霉Cs007發酵產酯水解酶提供了一個合適的模型，因此可用該模型分析和預測米曲霉Cs007發酵產酶情況。

2.4.3 響應因子水平的優化

根據表5的實驗結果作三維響應面圖，見圖4。

圖4 酶活與蛋白胨、KH2PO4和阿拉伯膠的響應面圖

由圖4可知，回歸模型存在最大值，該值穩定點在(-0.33825，-0.37806，-0.43989)，對應的X2、X4、X6實際取值為1.76、0.11、0.37，Y的最大預測值為6.59，即當蛋白胨、KH2PO4和阿拉伯膠質量濃度分別為1.76％、0.11％、0.37％時，該模型預測的最高酶活為6.59 U·mL-1。實際發酵酶活為6.49 U·mL-1，進一步說明該模型能夠較好地預測實際發酵情況。

2.5 搖床轉速和培養時間對產酶的影響

在上述優化的培養條件下(即橄欖油 1％，蛋白胨 1.76％，KH2PO40.11％，MgSO40.05％，NaCl 0.05％，阿拉伯膠 0.37％，起始pH值 5，培養溫度30 ℃)，進一步考察搖床轉速和培養時間對產酶的影響。

2.5.1 搖床轉速對產酶的影響

搖床轉速主要影響發酵液的溶氧濃度，米曲霉Cs007是好氧性菌種，在生長和產酶過程中要消耗大量的氧，所以發酵過程中應不斷振蕩來增加發酵液的溶氧濃度。培養時間為48 h，考察搖床轉速對產酶的影響，結果見表7。

表7 搖床轉速對產酶的影響

由表7可知，米曲霉Cs007的發酵過程需氧程度較高，低轉速條件下，不能滿足細胞產酶的需求；當搖床轉速提高到200 r·min-1時，產酶量最高，達到6.49 U·mL-1；再提高轉速，產酶量基本不變。因此，選擇200 r·min-1為最佳的搖床轉速。

2.5.2 培養時間對產酶的影響

搖床轉速為200 r·min-1，考察培養時間對產酶的影響，結果見圖5。

圖5 培養時間對產酶的影響

由圖5可看出，米曲霉Cs007培養24 h后酶活快速上升，48 h時酶活達到最高6.49 U·mL-1，60 h后酶活開始下降。因此，選擇48 h為最佳的培養時間。

3 結論

利用響應面方法結合單因子實驗確定米曲霉Cs007菌株最優培養條件為：橄欖油 1％(體積分數)，蛋白胨 1.76％(質量濃度)，KH2PO40.11％(質量濃度)，MgSO40.05％(質量濃度)，NaCl 0.05％(質量濃度)，阿拉伯膠 0.37％(質量濃度)，起始pH值 5，培養溫度30 ℃，搖床轉速200 r·min-1，培養時間48 h。優化條件下所產酯水解酶酶活達6.49 U·mL-1，比初始酶活2.8 U·mL-1提高了1.32倍。

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