γ-聚谷氨酸腺苷甲硫氨酸鹽的制備

王 鵬，詹長娟，楊軍方，李大力

(南京理工大學環境與生物工程學院，江蘇 南京 210094)

γ-聚谷氨酸(γ-Polyglutamic acid，γ-PGA) 是由谷氨酸通過γ-酰胺鍵結合形成的一種多肽大分子，應用于生物醫藥材料、化妝品、食品、分散劑、螯合劑、建筑涂料等領域[1～4]。目前，制備γ-PGA的方法有化學合成法、提取法、微生物發酵法，其中微生物發酵法較適合于工業化生產[5～7]。

S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine，SAM)也稱S-腺苷蛋氨酸，是人體內一種重要的生理活性物質，參與多種生化反應，如轉甲基、轉硫、轉氨丙基等，是半胱氨酸、牛磺酸、谷胱甘肽、輔酶A等重要物質的前體[8]，在治療肝炎、肝功能紊亂、關節炎、抑郁癥、心血管疾病以及抗衰老、防癌等方面發揮著重要作用，市場需求日益增大[8,9]。SAM在pH>5時易分解，與有機分子形成鹽有利于提高SAM的穩定性[10～12]。

作者利用從納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto) NL365發酵液中提取純化的γ-PGA，制備了γ-聚谷氨酸腺苷甲硫氨酸鹽(γ-PGA-SAM)，以利用γ-PGA的空間位阻來提高SAM的穩定性，有利于SAM在臨床上的應用。

1 實驗

1.1 菌種與試劑

納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto) NL365、釀酒酵母均為自行保存。

丁二磺酸腺苷甲硫氨酸，Abbott S.P.A.公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 培養基

納豆芽孢桿菌發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖30，酵母粉8，谷氨酸鈉60，NaCl 45，pH值7.0,于37 ℃、220 r·min-1搖床培養4 d。

釀酒酵母發酵培養基(g·L-1)：蔗糖40，NH4NO35，MgSO4·7H2O 0.4，ZnSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.2，CaCl20.3，K2HPO40.8，KH2PO40.8，酵母浸出物 3，L-甲硫氨酸4，pH值5.0，于30 ℃、150 r·min-1搖床培養24 h。

1.3 方法

1.3.1γ-PGA的提取與純化[13，14]

將納豆芽孢桿菌發酵液以10 000 r·min-1離心15 min除去菌體；在上清液中加入2 BV乙醇，用玻璃棒攪拌纏繞出γ-PGA；將γ-PGA粗品用去離子水重新溶解后，用1 mol·L-1硫酸調pH值為2，靜置過夜至出現白色絮狀沉淀；5000×g離心10 min，收集沉淀，用70％乙醇洗滌，冷凍干燥，即得純化的γ-PGA。

1.3.2 釀酒酵母細胞SAM的提取及其硫酸鹽的制備

將釀酒酵母發酵液以5000 r·min-1離心10 min，收集菌體；按150 μL·(g濕酵母)-1加入乙酸乙酯，劇烈攪拌30 min；加入18 mL 0.35 mol·L-1的硫酸，繼續攪拌1.5 h；5000 r·min-1離心10 min，收集上清液。

將D155樹脂預處理成H+型后裝柱(1 cm×60 cm)，用5～8倍柱體積的去離子水洗滌。將上述收集的上清液pH值調至5.0，流速2 mL·min-1，上樣量為1000 mL。用5倍柱體積的去離子水和0.1 mol·L-1乙酸依次洗脫雜質，得SAM；然后用0.35 mol·L-1硫酸以2 mL·min-1的流速洗脫，得到SAM硫酸鹽。在此過程中用HD 21-2型紫外檢測儀進行監測(A260)，收集主峰。

1.3.3γ-PGA-SAM的制備

將經離子交換純化的γ-PGA凍干品用去離子水配成0.02 g·mL-1的溶液。用2 mol·L-1NaOH溶液調節SAM硫酸鹽的pH值為4.0，按SAM與γ-PGA中谷氨酸殘基摩爾比為1∶5的比例加入γ-PGA溶液，攪拌1～2 h后，12 000×g離心10 min，在上清中加入2 BV無水乙醇，低溫(4 ℃)沉淀過夜。12 000×g離心10 min，收集沉淀物，用無水乙醇清洗沉淀，干燥，得到γ-PGA-SAM。

1.4 結構表征

1.4.1 高效液相色譜(HPLC)分析

將γ-PGA-SAM凍干品用一定體積的蒸餾水溶解，取1 mL加入2 BV 0.35 mol·L-1硫酸處理2 h，12 000×g離心10 min，取上清液用微孔濾膜過濾后，用LC-10AT型高效液相色譜儀(島津)進行HPLC分析[9]。以經相同處理的丁二磺酸腺苷甲硫氨酸為標準品對照。

色譜條件：VP-ODS色譜柱(Shimadzu Corporation)，流動相為0.01 mol·L-1甲酸銨溶液(pH值4.0)，流速1 mL·min-1，檢測波長254 nm。

1.4.2 核磁共振氫譜(1HNMR)分析

γ-PGA-SAM凍干品的氫譜采用預飽和技術壓制水峰獲得，由南京高聚物納米復合材料工程技術中心完成。

2 結果與討論

2.1 γ-PGA的提取與純化結果

從納豆芽孢桿菌發酵液中提取γ-PGA的收率為9.33 g·L-1。純化的γ-PGA為白色粉狀。SDS-PAGE電泳結果與文獻[14]相同，平均分子量約為1×106。

2.2 SAM的提取結果

酵母細胞破壁處理后的上清液中除了含有SAM，還含有許多雜質。離子交換層析后雜質明顯減少，分離效果較好，SAM收率為67.5％。

2.3 產物γ-PGA-SAM的表征

2.3.1 HPLC分析

γ-PGA-SAM樣品經硫酸處理后進行HPLC分析，結果見圖1。

圖1 γ-PGA-SAM樣品經硫酸處理后的HPLC圖譜

HPLC分析發現，γ-PGA-SAM樣品經硫酸處理后的峰形與標準對照品丁二磺酸腺苷甲硫氨酸的峰形(結果未顯示)一致，說明在γ-PGA-SAM的制備過程中SAM沒有被破壞。

2.3.21HNMR分析

對丁二磺酸腺苷甲硫氨酸、γ-PGA樣品以及γ-PGA-SAM樣品進行1HNMR分析，結果見圖2。

圖2 丁二磺酸腺苷甲硫氨酸、γ-PGA樣品及γ-PGA-SAM樣品的1HNMR圖譜

由圖2可以看出，丁二磺酸腺苷甲硫氨酸、γ-PGA樣品以及γ-PGA-SAM樣品的1HNMR圖譜中箭頭標注的A、B、C、D 4部分發生了明顯的變化。丁二磺酸腺苷甲硫氨酸分子C處δ4.45、δ4.48歸屬于丁二磺酸腺苷甲硫氨酸分子核糖2、3、4位碳上質子的化學位移，γ-PGA樣品C處δ4.29歸屬于γ-PGA分子α碳上質子的化學位移，γ-PGA-SAM樣品C處的峰并不是兩者的簡單疊加，而是向高場發生了移動；丁二磺酸腺苷甲硫氨酸分子D處δ2.83歸屬于丁二磺酸腺苷甲硫氨酸分子中與硫相連的甲基上質子的化學位移，具有精細結構，γ-PGA樣品在D處沒有峰，而γ-PGA-SAM樣品在D處則表現為一個寬分布，這是典型的高分子化的特征。

3 結論

高效液相色譜、核磁共振氫譜分析結果表明，用γ-聚谷氨酸與S-腺苷甲硫氨酸反應制得的產物并不是γ-聚谷氨酸與S-腺苷甲硫氨酸的簡單混合，而是γ-聚谷氨酸腺苷甲硫氨酸鹽。S-腺苷甲硫氨酸分子中嘌呤環上的氨基、氨基酸鏈上的氨基以及極性較強的锍基都帶正電荷，可與聚陰離子γ-聚谷氨酸的羧基之間發生相互作用。制得的γ-聚谷氨酸腺苷甲硫氨酸鹽對提高S-腺苷甲硫氨酸的穩定性具有重要意義。

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