標準化實時熒光定量PCR技術流程

曹龍凱，郭春華

（西南民族大學生命科學與與技術學院，動物遺傳育種國家民委-教育部重點試驗室，成都 610041）

隨著分子生物學的發展，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術已經成為檢測不同樣品間基因表達水平定量差異的權威性方法，但是也出現了許多缺陷，包括試驗設計不合理、對照和重復缺乏、分析方法和報告形式多樣、RNA樣品質量、引物和探針低劣選擇等。實時熒光定量PCR試驗出版物所需最小信息量（MIQE）是一套國際新推出的指導方針，對RT-qPCR的試驗和發表文章所必需的信息提出了最低限度的標準[1]。MIQE與蛋白質組學試驗、基因組序列、RNA干擾、代謝研究和NDA微陣列分析的國際標準一樣，作為RT-qPCR的國際標準——MIEQ也被收入MIBBI[2-8]。MIQE對RT-qPCR的過程做了詳盡的闡述，從而使科學工作者能獲得一致的、高質量的RT-qPCR試驗數據。按照這一標準，可以規范試驗操作，提高研究者對試驗結果的可信度，增強試驗的透明度，促進試驗室之間的一致性，進一步規范qPCR的儀器和試劑的研發生產[9-12]。

MIQE所提供的檢測列表包含85個參數，滿足了所有雜志的評審標準，確保了試驗結果的質量，應對mRNA轉錄的高動態性和樣品操作及下游處理步驟的多變性，使通過該標準評估的試驗結果具有一致性、可靠性和可比性[1]。另外，還規范了RT-qPCR的專用術語，以統一實時定量PCR的試驗數據[13]。

根據MIQE指南，一個典型的RT-qPCR試驗流程包括試驗設計、RNA提取、引物和探針設計、RT-PCR、數據分析、對照組、重復數。從試驗條件到樣品操作，都要進行精心的安排。本文介紹了一套標準化的RT-qPCR的試驗方法，為RT-qPCR試驗提供參考。

1 RT-qPCR試驗設計

由于mRNA的超敏感，反應需要在嚴格的調控下進行，適當的試驗設計是研究基因表達成功的關鍵，花一定的時間在試驗設計上是很必要的。試驗設計內容包括樣品抽提方法、保存方法、解凍和均質化過程、對照組設置、靶基因和內參基因選擇，生物學和技術重復次數等都要進行嚴格的考慮，從而可以減少試驗結果的可變性，保證其順利進行。

2 RNA提取

2.1 RNA提取的原理和方法

組織總RNA提取的實質就是將細胞裂解，釋放出RNA，并通過RNA的純化去除蛋白質、DNA等雜質，最終獲得高純度RNA的過程。

細胞裂解法有苯酚法和β-巰基乙醇法。苯酚法是一種傳統的RNA提取方法，適用于大多數動植物材料，但對次生代謝產物較多的植物材料提取RNA效果較差；β-巰基乙醇法適用于各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料；對于次生代謝物多的材料，一些生物公司亦推出了RNA提取試劑，不同的提取方法適用于不同的樣本材料，試驗者可根據自己的需要進行選擇。

RNA的純化及沉淀方法包括有機溶劑抽提法和硅基質吸附法。有機溶劑抽提法通常用氯仿抽提RNA，去除蔗糖、蛋白質等雜質；硅基質吸附法是利用硅基質對核酸特異的吸附能力，該法因操作方便、快捷、不使用有毒的溶劑（苯酚、氯仿）等優點，成為了核酸純化的首選。

現在的RNA提取試劑盒綜合了上述細胞裂解和RNA純化的一系列步驟，提取方便，易于操作，是一種理想的試劑盒。但若要提取一些特殊的樣品，可選用專用的試劑盒，例如動物組織提取試劑盒，該類試劑盒比綜合提取試劑盒效果更好。另外，在使用前應對試劑盒的質量進行檢測，以達到預期的效果。

2.2 樣品的預處理

樣品的預處理方法要根據樣品的不同來選擇不同的方法，植物材料需要液氮研磨，動物材料需要勻漿、液氮研磨，細菌需要用溶酶菌破壁，酵母需要液氮研磨、玻璃珠處理或lyticase酶法破壁。如果樣品在采集后無法立即處理，需要放置一段時間，應先將材料在液氮中速凍后保存于-80℃冰箱或直接保存在液氮中。

3 RNA質量的控制

RT-qPCR試驗流程中，高純度和高完整性的RNA是試驗的關鍵。不純的RNA樣品會抑制PCR反應，產生偏離的數據；不完整的RNA會產生不正確和可變的定量結果[14]。RNA用于不同的后續試驗，對其質量要求不盡相同，cDNA文庫構建要求RNA完整且無酶等抑制物殘留；Northern blot試驗對RNA完整性要求較高，對酶反應抑制物要求較低；RT-PCR試驗對RNA完整性要求不太高，但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。

3.1 RNA純度的檢測

采用分光光度法檢測RNA的純度，以OD260/230值作為參考值。OD260/280值為1.9～2.1，可以認為RNA純度較好；OD260/280值＜1.8，則表明有蛋白質雜質；OD260/280值＞2.1，說明RNA已經降解；OD260/230值＞2.0，則表明裂解液中有β-巰基乙醇和異硫氰酸胍殘余。另外，采用TE溶解或洗脫RNA會使OD260/280值增加?？俁NA濃度的計算公式見式（1）：

3.2 RNA完整性鑒定

根據后續試驗的不同，對鑒定的要求也有所差異。一般可分為變性電泳和常規電泳，由于變性電泳操作步驟比較復雜，所以在不太嚴格的試驗中，RNA的電泳可以用常規的1%瓊脂糖凝膠電泳。總RNA在普通瓊脂糖凝膠電泳上出現的條帶與變性凝膠上的一致，可以觀察到一大一小（28S和18S）兩條帶，其大條帶的亮度是小條帶亮度的200%，則提示RNA完整，這種方法成本低，但判斷上具有一定主觀性，并且需要總RNA 200 ng，如果樣品稀少，則相對浪費。使用光密度掃描儀對rRNA條帶的亮度進行掃描可以改善上述方法，雖然28S/18S的值在不同組織中有所變動，不過比值為1～2，則說明RNA樣品的完整性好。

然而對RNA完整性要求較高的后續試驗，如Northern blot和cDNA文庫的構建，則需要通過微流體電泳系統，對RNA的完整性做出客觀的、準確的評判[15]。該系統是目前對RNA的濃度質量（從pg到ng級）和完整性的檢測最完善的系統，可以生成一塊虛擬膠，基于電泳圖的多個標準，也可以提供RNA樣品的客觀判斷以及降解樣品的篩選[16]。

綜上所述，通過確保RNA的純度和質量的一致性可以降低生物學重復的差異[15]。建議在RNA樣品符合標準時應立即進行RT-PCR，以便在檢測后保持其完整性。

4 引物和探針設計

引物設計是PCR步驟中十分關鍵的一步，引物的好壞決定著試驗的成功與否。對于RT-qPCR，引物設計和目標序列選擇的要求就更嚴格了。依照MIQE指南，熒光定量PCR的引物必須是以兩個外顯子設計引物，避免基因組DNA的擴增，且在發表文章中必須提供每個目的基因和對照基因的da?tabase檢索編號，引物和探針的外顯子位置。

設計引物應注意先選擇好探針，然后再設計引物，使之盡可能的靠近探針；所選序列應是高特異的，盡量選擇最小二級結構的擴增片段，設計時應先檢驗，若無法避免就要相應提高退火溫度；擴增片段的長度應＜400 bp，理想的是100～150 bp，太短也有其弊端，如影響片段回收；GC含量應在50%～65%，GC含量太高，影響引物的退火溫度，其容易產生非特異性擴增，從而影響擴展增效率及產生非特異信號；盡量避免連續的G或C出現；引物和探針配檢，以避免二級結構和發夾結構的產生；合成好的探針，在用之前要先離心，用雙蒸水（滅菌）稀釋成25 pmol·μL-1的濃度，然后于-20℃避光保存。

設計引物需要的軟件有Primer 6.0（設計夸外顯子引物）、Primer 5.0（檢測上下游引物的錯配）、Ol?ige 6.0（檢測上、下引物的二級結構和發夾結構出現能值的高低）。另外，設計好的引物還要通過NCBI中的Primer-Blast來進行比對，以確保目的基因的特異性。MFOLD程序可用來分析擴增子是否存在阻礙有效擴增的二級機構[17]。

5 反轉錄、擴增產物的驗證和RT-qPCR擴增

反轉錄和RT-qPCR擴增中，MIEQ規定聚合酶的濃度和性質、cDNA的量、鎂離子濃度、buffer的化學成分、反應體積以及RT-qPCR儀的循環條件都必須注明。

5.1 反轉錄

由于RNA酶在環境中廣泛存在，RNA提取完成后，應盡快進行反轉錄以避免RNA樣品在反轉錄之前反復凍融而導致RNA樣品的降解。在確保RNA質量后，即可進行反轉錄。在引物的選擇方面，根據RT引物數據庫且視試驗的具體情況而定，選擇隨機引物、Oligo dT及基因特異性引物，對于短的不具有發夾機構的真核細胞mRNA，3種引物都可以[18-19]。

RT-PCR分為一步法和兩步法，可以根據不同目的選用不同的方法。若要達到高靈敏度的效果，建議用一步法；如果RT-PCR使用不同的引物，同時要得到高特異、高保真、長的反轉錄結果，就采用兩步法。此外，MIQE中對反轉錄過程要求設置無轉錄（NRT）對照。

5.2 擴增產物的驗證

RT-qPCR之前，要對引物進行驗證，驗證擴增產物是否是目的片段。具體做法是：做普通PCR，然后膠回收產物，連接到質粒上；對質粒進行測序，確定是目的片段。

5.3 RT-qPCR擴增與驗證

RT-qPCR擴增流程中，PCR的效率、線性動態范圍、退火溫度、融解曲線、擴增子的凝膠電泳分析以及染料法所需要的試劑等，都要經過測定和校準[20-21]。引物的優化、引物濃度、退火溫度都會影響到PCR的效率，進而影響試驗的質量。

通過標準曲線的建立，來評價PCR的擴增效率。定量標準物可以是cDNA、質粒DNA、特定生物體樣本的RNA或DNA以及是世界上公認的生物學標準物。對于定量標準的稀釋MIQE也做了詳細的闡述，另外歸一化是可信賴的RT-qPCR的重要組成部分[22-23]。目前，常用△△Cq法對樣品和Ref?erence RNA基因不同濃度進行歸一化，從而可以控制由抽提率、反轉率和擴增效率產生的差異[24]。但是目的基因和對照基因必須在相似的擴增效率下。MIQE規定，在所提交的文章中，不僅要有標準曲線，還要有注明斜率值，擴增效率=10-1/slope-1。

擴增效率的高低可以直接出PCR問題，低的擴增效率（＜90%）可能是由于Tag酶的活性低，抑制劑的污染，退火溫度未優化，引物設計不合理或擴增子含二級結構；過高擴增效率（＞105%）的原因一般是由于引物二聚體或非特異性擴增，不過人為的操作不當移液器的不準或不當操作、離心不當等而影響擴增效率的高低是經常發生的。

在繪制標準準曲線中，樣品稀釋倍數應確保覆蓋試驗中可能用到的模板濃度，寬的動態范圍是必須的。理想狀態下，擴增曲線的分布是均一的，間隔也代表著每次擴增的倍數，擴增效率應保持在90%～105%。標準曲線的r或R2可代表符合回歸曲線的程度，RT-qPCR理想的r絕對值應＞0.990或R2＞0.998。使用Excel電子表格添加趨勢線功能，以確定每對引物的使用cDNA動態濃度。

6 數據分析

數據分析方法因所選定量方法的差異而有所差異。絕對定量是通過樣品的Cq值與標準曲線進行比較得到的；相對定量是一定量的試驗組和對照組中目的基因的相對比率。無論是絕對定量還是相對定量，試驗數據的校準是必不可少的；絕對定量中每次的試驗標準樣品必須與待測樣品同時平行擴增；而相對定量在比較多個樣本時，選擇一個樣品作為對照樣本，其他所有樣本目標基因的表達都以對照樣本上調或下調，一般以基準或未處理樣本作為對照。

6.1 內參基因

在RT-qPCR試驗中，內參基因被用來作為數據標準化的對照，以校正作為模板得cDNA所存在得數量差異[25]。一個好的內參基因應確保在不同的組織、不同的處理條件下表達都無變化。往往在試驗中，要選用多個內參基因進行比較，而選擇好的內參基因，才能使試驗數據被信服。不同的條件或時間點下△Cq≤0.5。建議在試驗中同時檢測至少3個或3個以上位于不同代謝途徑中的特定內參基因，并對表達差異最小的幾個基因進行幾何平均以準確標準化數據[26-29]。

內參基因確定以后，可以采用Livak法，也就是2-△△Ct法、參照基因的△Ct法或Pfaffl法進行分析，每種方法都有優缺點。

6.2 試驗重復性與重現性

試驗的重復性與重現性是必須考慮的因素，因為在試驗中有兩種可變因素可能會影響到試驗的準確性和重復性。分別是生物學差異和技術差異。生物學差異是不同個體或組織樣品間基因表達的差異所致；技術差異是試驗藥品、器材不同和操作不當等人為因素導致。為了減少生物學和技術差異對試驗帶來的影響，可以通過試驗設計加以避免。一般除了設置對照組，每個樣本還要設置3個生物學重復，并且每個重復要設置至少兩個技術重復，另外，再加上兩個無模板（NTC）對照。如果試驗是在對照組和處理組之間進行的比較，設置的3個生物學重復樣品應該來源于獨立試驗中分別進行處理的樣品[30-31]。

7 展 望

實時熒光PCR技術自建立以來，發展迅速、應用廣泛，表現出許多優勢。近些年來，許多科研工作者基于熒光PCR的基本原理對熒光PCR技術進行不斷深入的研究和改進，使熒光PCR技術得到了進一步的完善，并在此基礎上開發出了許多新的熒光PCR技術。隨著標準化的實時熒光PCR技術的不斷發展該技術將在生物學、醫學基礎研究以及試驗動物學等廣泛的領域中得到更加廣泛的推廣應用。

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