間接競爭ELISA法檢測飼料中鹽酸克倫特羅的探討

劉立波

（河北唐縣農業局，河北 唐縣 072350）

鹽酸克倫特羅（CLB）又稱鹽酸雙氯醇氨、氨哮素、克喘素，化學名稱為α－（[叔丁氨基）甲基]－4－氨基－3，5－二氯苯甲醇鹽酸鹽[1]。CLB主要用于治療人和家畜的支氣管哮喘，但其對人體有很強的副作用，其半衰期長，在體內代謝慢，極易積蓄在肝臟、腎臟等器官中。中毒表現主要為肌肉震顫、頭疼、心悸等。同時CLB具有蛋白質同化作用，在動物體內代謝過程中促進骨骼肌蛋白質的合成，對脂肪的合成有一定的抑制作用，可以減少脂肪的形成，提高瘦肉率[2]。因此，一段時間以來CLB被作為一種促生長添加劑而倍受重視。

不法飼料生產商和養殖戶將CLB加入到飼料或飲用水中，用以促進生豬、牛、羊的生長，提高瘦肉率。通過飼喂會使其殘留在動物的內臟及肌肉組織中，人類食用殘留CLB的動物產品發生中毒，通常表現為面色潮紅、頭痛、胸悶、心悸、心慌、骨骼肌震顫、四肢麻木等一系列不良反應。對心律失常、高血壓、青光眼、糖尿病、甲狀腺機能亢進、前列腺肥大等疾病的患者有較大的危害甚至危及生命[3]。故當前我國立法禁止將鹽酸克倫特羅作為飼料藥物添加劑使用。加強對飼料產品中CLB的監測，可以保障食品安全，從而保護人的建康與安全。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇飼料樣本16份作為試驗材料，其中8份來自經過河北省飼料檢測中心檢測的不含鹽酸克倫特羅的樣本，另外8份來自于銷售市場的隨機抽樣。

1.2 主要儀器和試劑

酶標儀；微量移液器（20、50、100μL）；96孔酶標板1塊（包被有偶聯抗原）；標準液6瓶：（1 mL/瓶）0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ppb；高濃度標準品：100 ppb 1mL；酶標二抗7mL；克倫特羅抗體工作液7mL；底物液A液、B液（TMB底物溶液）各7mL；終止液7mL；20×濃縮洗滌液40mL。

1.3 檢測原理

鹽酸克倫特羅間接競爭ELISA檢測試劑盒基于間接競爭性酶聯反應原理，在酶標板微孔板上預包被偶聯抗原，樣本中殘留的CLB和微孔板上預包被偶聯抗原競爭抗CLB抗體，加入酶標二抗后，用底物顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物鹽酸克侖特羅的含量成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣品中CLB的含量[4]。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品中鹽酸克倫特羅的提取

將飼料樣本用研缽研碎，用電子天平稱取粉碎的樣本2.0 g，然后將此樣本加入50mL離心管中，加入2mol·L－1的鹽酸溶液中，加入蒸餾水16mL，用力反復搖晃，然后放置超聲波水浴中超聲30 min。用3 000 rpm離心20min，取出上清液加入氫氧化鈉溶液2mL（1mol·L－1）混合均勻，將pH調至6.5～7.5，3 000 rpm離心20min，取100μL上清液和900μL蒸餾水混合，取用20μL備用。

1.4.2 樣品中鹽酸克倫特羅的測定

依據中華人民共和國農業行業標準NY－T1460－2007《飼料中鹽酸克倫特羅的測定酶聯免疫吸附法》方法測定[5]。

1.5 標準曲線制備

將6個濃度的鹽酸克倫特羅的標準溶液（0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ppb）和待測溶液按限量法測定步驟測定相應的吸光度值。百分吸光率的計算法見式（1）。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0 ppb標準溶液的平均吸光度值

以百分吸光率為縱坐標，以克侖特羅標準品濃度（ppb）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 飼料樣品中鹽酸克侖特羅的測定結果

飼料樣品中鹽酸克侖特羅的測定結果見表1。

表1 飼料樣本檢測結果

依據中華人民共和國農業行業標準NY－T438－2001《飼料中鹽酸克倫特羅的測定》，中華人民共和國農業行業標準NY－T1460－2007《飼料中鹽酸克倫特羅的測定酶聯免疫吸附法》，中華人民共和國國家標準GB/T22147－2008《飼料中沙丁胺醇，萊克多巴胺，鹽酸克倫特羅的測定液相色譜質譜聯用法》中規定CLB檢測限為0.01mg·kg－1，CLB定量限為0.05mg·kg－1，飼料在處理過程中被稀釋100倍，表1中檢測樣1～6是測定飼料中添加CLB用以測定回收率，樣本7～17是抽檢的飼料樣本，可以看出，目前市場上的飼料產品中沒有添加違禁藥物CLB，飼料的質量安全可靠[5－6]。

2.2 樣品陽性添加物回收率

在經本方法測定過的不同飼料樣本中準確加入一定量的鹽酸克倫特羅，按同樣的操作過程提取、測定，計算回收率。平均回收率為96.9%。陽性添加物回收率結果見表2。

表2 陽性添加物回收率

通過表2可以看出，陽性添加回收率平均達到96.9%，符合試劑盒中所規定的85%～95%的回收率數值，表明此次檢測準確可靠。賈濤研究表明，酶聯免疫方法具有操作簡便、靈敏度高、成本低的優點，鹽酸克倫特羅酶朕免疫反應測試盒為養殖者和政府監督管理部門提供了更準確快速檢測克倫特羅殘留的方法，該試劑盒的提取方法能達到75%～95%的回收率，可以不需用有機溶劑并在10～30min完成提取過程。該法具有靈敏度高（0.05 ng·g－1）、檢測下限低（肉類/脂肪 0.025 ng·g－1、尿液 0.05 ng·mL－1、飼料0.2 μg·kg－1）、檢測時間≤2 h；重復性高的特點[7]。

3 結論

間接競爭ELISA法可以直接用于測定飼料中鹽酸克倫特羅含量，具有良好的靈敏度和穩定性。

[1]陳啟佳.鹽酸克倫特羅在肉制品中的危害及其檢測方法研究進展[J].肉類研究,2011（6）:58－60.

[2]王海花,黃素珍.鹽酸克倫特羅的危害性與檢測[J].動物醫學進展,2003（4）:41－43.

[3]翟福麗,賴克強,張衍亮,等.動物性食品中β-興奮劑殘留概述[J].食品科學,2011（5）:351－356.

[4]Jiang JQ,Zhang H T,Wang Z L.Preparation and Identification ofanti－RactopamineMonoclonalantibodies[J].IPCBEE,2011（3）:78－81.

[5]中華人民共和國農業行業標準.NY－T1460－2007飼料中鹽酸克倫特羅的測定.酶聯免疫吸附法[S].北京:中國農業出版社,2008.

[6]中華人民共和國國家標準.GB/T22147－2008飼料中沙丁胺醇,萊克多巴胺,鹽酸克倫特羅的測定.液相色譜質譜聯用法[S].北京:中國標準出版社,2008.

[7]賈濤.酶聯免疫法檢測鹽酸克倫特羅的試驗報告[J].北京農業,2007,33:47－54.