反相高效液相色譜法測定可樂中咖啡因的含量

武開業(yè)

（榆林市環(huán)境監(jiān)測總站，陜西 榆林 719000）

0 引 言

咖啡因（C8H10N4O2）是從茶葉、咖啡果中提煉出來的一種甲基黃嘌呤的生物堿，化學(xué)名是1，3，7-三甲基黃嘌呤或 3，7-二氫-1，3，7 三甲基-1H-嘌呤-2，6-二酮，純的咖啡因是白色而具有強(qiáng)烈苦味的粉狀物，易溶于水、乙醇、丙酮及氯仿等有機(jī)溶劑。

各國制定了咖啡因在飲料中的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，美國、加拿大、阿根廷、日本、菲律賓規(guī)定飲料中咖啡因的含量不得超過200μg/mL，南斯拉夫規(guī)定不得超過120μg/mL，到目前為止我國僅允許咖啡因加入到可樂型飲料中，其含量不得超過150μg/mL。為了加強(qiáng)食品衛(wèi)生監(jiān)督管理，對飲料中咖啡因的含量進(jìn)行測定是十分必要的。

咖啡因的測定一般采用紫外分光光度法，其優(yōu)點(diǎn)是響應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高、操作簡單，缺點(diǎn)是重復(fù)性差、回收率低，這可能與光源的穩(wěn)定性以及試樣的前處理步驟比較繁瑣有關(guān)。

因此，本文采用反相高效液相色譜法（RPLC）測定可樂中咖啡因。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters 1525雙泵高效液相色譜儀（美國沃特斯公司）；色譜前處理柱；0.45μm濾膜過濾裝置（上海摩速有限責(zé)任公司）；萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；25μL微量注射器（Australia）；KQ-50B超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%以上，廣佛精細(xì)化工公司）；CH3OH（色譜純）；三氯甲烷（分析純）；無水硫酸鈉（分析純）；氯化鈉（分析純）；試劑用水為18.2MΩ二次去離子水。

圖1 咖啡因的結(jié)構(gòu)式

1.2 色譜條件

Diomonsil C18（2）5 u 色譜柱（250mm×4.6mm，柱溫 30℃）；流動相為甲醇/水（4∶1，流速 1mL·min-1）；紫外檢測器。

1.3 樣品前處理

由于可樂中含有大量的有機(jī)物，這些物質(zhì)通過色譜柱以后會對柱子造成很大的損害，所以需要對可樂進(jìn)行前處理。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一款樹脂填充的色譜前處理柱。樣品用超聲清洗器在40℃下超聲5min，然后經(jīng)前處理柱過濾，除去絕大部分的有機(jī)物，最后經(jīng)過0.45μm水系濾膜過濾后方可進(jìn)樣。

前處理柱管用一般滴定管改制而成，上層填充吸附樹脂（YXA05型40～100目），下層填充陽離子交換樹脂（Y2X8型100～150目）。吸附樹脂在裝前按照以下步驟凈化：丙酮浸泡過夜——抽干——甲醇鹽酸溶液（1∶1）浸泡4h——過濾——甲醇洗——水洗；陽離子交換樹脂在裝前經(jīng)下述步驟凈化：甲醇浸泡過夜——過濾——5%HCl浸泡4 h——水洗至無氯離子。裝柱時(shí)應(yīng)先裝陽離子交換樹脂，再裝吸附樹脂，用去離子水沖洗預(yù)處理柱，直至流出液無氯離子為止。分析可樂試樣時(shí)，取一定量試樣，使其流過預(yù)處理柱，再用去離子水沖洗，洗水體積應(yīng)大于床體積5倍以上，收集樣液和洗液，定容以后通過0.45μm濾膜進(jìn)行過濾，然后通過色譜柱進(jìn)行分析。預(yù)處理柱可以連續(xù)處理試樣，通常用約一個(gè)月后用甲醇鹽酸溶液（9∶1）洗滌，再用去離子水洗凈后又可使用。實(shí)驗(yàn)證明本方法可以清除試樣中有機(jī)物（油溶性）等污染物質(zhì)，而預(yù)處理柱對咖啡因不發(fā)生吸附（回收率大于96%）。色譜前處理柱形狀如圖2所示。

圖2 色譜前處理柱

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇優(yōu)化

本方法的主要目的就是檢測可樂中咖啡因的含量，采用美國沃特斯公司的Diomonsil C18（2）5u色譜柱，實(shí)驗(yàn)表明該色譜柱對咖啡因有很好的分離性能。

通過選擇比較不同的波長條件，發(fā)現(xiàn)咖啡因甲醇溶液在286nm波長下有很大的吸收且與其他物質(zhì)的吸收峰很好地分開，所以選擇286nm為測定波長。

通過比較不同的淋洗液體系，發(fā)現(xiàn)甲醇/水體系能夠很好地分離咖啡因，不會出現(xiàn)峰拖尾、鬼峰以及其他峰不完全分離的情況。經(jīng)過不同的濃度優(yōu)化，最終選擇甲醇/水（4∶1，流速 1mL·min-1）作為流動相，咖啡因在4min完全出峰。咖啡因色譜圖見圖3。

圖3 咖啡因色譜圖

2.2 方法的精密度、線性關(guān)系和檢出限

配制濃度為 10，20，50，100，150μg/mL 的咖啡因甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度在286nm波長下測定6次峰面積響應(yīng)值，RSD在0.18%～1.36%之間。分別測定不同濃度的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，咖啡因濃度在10～150μg/mL范圍內(nèi)與峰面積值呈良好線性關(guān)系，Y＝1.7×104X-9.99×103，相關(guān)系數(shù)為 0.9998，方法檢出限為為0.72μg/mL。

2.3 實(shí)際樣品測定

以不同品牌的可樂飲料為實(shí)驗(yàn)對象，測定其中含有的咖啡因含量，見表1。

表1 實(shí)際樣品測定結(jié)果及回收率

方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在0.38%～1.81%之間，同時(shí)做回收率實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)回收率為96.8%～101.8%。

3 結(jié)束語

可樂類飲料是一種組成復(fù)雜的溶液，其中含有的大量色素和其他有機(jī)類添加劑，對于可樂成分的分析造成了很大的干擾。通過色譜前處理柱的應(yīng)用，有效去除了這些干擾組分的影響，實(shí)際應(yīng)用表明，運(yùn)用液相色譜法可以快速、準(zhǔn)確地測定出了可樂飲料中的咖啡因含量，符合食品及無公害飲料標(biāo)準(zhǔn)要求。

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