人正常泌尿系上皮細胞系作為組織工程化尿道種子細胞的可行性研究

[摘要]目的：研究人正常泌尿系上皮細胞系（SV-HUC-1）在傳代20代之后的性質變化，探討將其作為組織工程化尿道研究種子細胞的可行性。方法：對于SV-HUC-1傳代20代的細胞進行形態觀察，應用RT-PCR法和間接免疫熒光法檢測細胞標志蛋白表達。應用Cell TrackerTMBlue CMF2HC，進行活細胞示蹤研究。結果：對于第20代SV-HUC-1細胞，應用倒置相差顯微鏡觀察生長到其形態正常。應用RT-PCR法和間接免疫熒光法均檢測到第20代SV-HUC-1細胞中Vimentin和CK-18的mRNA表達。應用研究活細胞示蹤研究，在第20代SV-HUC-1細胞中加入活細胞示蹤劑Cell TrackerTMBlue CMF2HC后，發現SV-HUC-1細胞生長良好。結論：SV-HUC-1細胞能夠正常生長傳代20代，形態正常，能夠表達泌尿系上皮細胞的標志蛋白，并能以活細胞的方式進行示蹤和觀察。SV-HUC-1細胞系是適合作為尿道組織工程實驗用的種子細胞。

[關鍵詞]SV-HUC-1；組織工程；尿道；上皮細胞系

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）03-0433-03

Study of the Possibility of Human Urethral Cell as Seed cell of Urethral Tissue Engineering

FAN Wei-wei，LV Wei，FAN Ju-feng

(Department of Plastic Surgery，Beijing Chaoyang Hospiatal of Capital Medical University，Beijing 100020，China)

Abstract: Objective To investigate the property of the 20th passage of SV-HUC-1 cell line.To study of the possibility of human urethral cell as seed cell of urethral tissue engineering. Methods We observed the morphology of the 20th SV-HUC-1 generation cell. RT-PCR and indirect immunohistochemistry dyeing were used to detect signal protein expression of the cells. Cell TrackerTM Blue CMF2HC was used to trace the live cells. Results The morphology of the 20th SV-HUC-1 cells was normal under the inverted phase contrast microscope. Vimentin and CK-18 was detected through RT-PCR and indirect immunohistochemistry dyeing. The 20th passage of SV-HUC-1 cells grew well after they were input Cell TrackerTM Blue CMF2HC. Conclusions The SV-HUC-1 cells can be culture to the 20th passage. They can express the signal protein of urinary epithelial cells. The morpaholgy of cells is regular. They can be investigated and traced with the live cells. The SV-HUC-1 cell line is a good choice of seed cells for urethral tissue engineering.

Key words: SV-HUC-1; tissue engineering; urethra; endothelial cell line

尿道下裂和尿道上裂的研究與組織工程化尿道的研究密切相關。但是來自人體和實驗動物的成體細胞作為種子細胞的研究往往受限于種子細胞在培養傳代一定代數后就會發生性質改變，從而無法進行大量傳代而獲得大量細胞。種子細胞的選擇，成為了尿道組織工程研究的瓶頸之一。能否繞過種子細胞對于實驗過程的干擾，找到為一種理論上可以反復傳代而不發生變性的尿道黏膜上皮細胞作為種子細胞進行研究呢？筆者選擇了人正常尿道上皮細胞系（SV-HUC-1），對其進行體外培養傳代，并對其傳代20代后的性質進行了檢測。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞及主要試劑：人正常尿道上皮細胞系（SV-HUC-1）購自美國ATCC（產品編號CRL-9520 ）、F-12K培養基（美國Invitrogen公司）、胎牛血清（FBS）（美國HyClone公司）、胰蛋白酶（美國Sigma公司）。

1.2 主要儀器：CO2恒溫培養箱（日本Napco公司，型號：5410）、超凈操作工作臺（北京半導體設備一廠）、倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）、低速離心機（北京醫用離心機廠，型號：LD4-2）、電子精密天平（上海精科天平廠，型號：FA1104）、高溫烤箱（日本Sakura公司，型號：HE-21）、超聲波細胞粉碎機（寧波新芝科器研究所，型號：JY-96-2）。

1.3實驗方法

1.3.1 配制主要溶液：含10%FBS的F-12K培養液，胰蛋白酶（0.05%）-EDTA（0.02%）溶液，細胞凍存液。

1.3.2 細胞培養與傳代：SV-HUC-1細胞以含10%滅活胎牛血清（FBS）的F-12K培養基在37℃、含5%CO2的培養箱內培養。每2天更換培養基，細胞生長至70%融合后用于后繼實驗。連續傳20代，取細胞用于下一步鑒定。

1.3.3 細胞鑒定：將細胞裂解后提取總RNA，逆轉錄后得到cDNA，以波形蛋白（Vimentin）和角蛋白-18（CK-18）的引物進行擴增，得到相應大小的片段。以間接免疫熒光染色的方法對細胞的Vimentin和CK-18進行染色，進一步證實其蛋白的表達。

1.3.4 活細胞示蹤：選擇CellTrackerTM Blue CMF2HC (美國英杰公司，產品編號C12881)作為活細胞示蹤劑，工作濃度為15μM，對生長至70%融合的第20代的SV-HUC-1細胞進行40min標記，然后PBS洗脫未進入細胞的示蹤劑，換培養基繼續培養48h后，以4%的甲醛固定。

2 結果

2.1 細胞培養：應用倒置相差顯微鏡觀察生長至不同融合度的第20代SV-HUC-1細胞，可見其為形態正常的SV-HUC-1細胞（圖1）。

2.2 細胞鑒定： 應用兩種鑒定方法予以鑒定。應用RT-PCR法檢測第20代SV-HUC-1細胞中Vimentin和CK-18的mRNA表達。應用間接免疫熒光法檢測到第20代SV-HUC-1細胞中CK-18的蛋白質表達（圖2）。上述兩項鑒定實驗證實第20代SV-HUC-1細胞中Vimentin和CK-18的mRNA均表達，從而明確該細胞具有的SV-HUC-1細胞的標志蛋白表達。

2.3 活細胞示蹤：第20代SV-HUC-1細胞中加入活細胞示蹤劑Cell TrackerTM Blue CMF2HC后，以熒光顯微鏡觀察細胞的生長情況，SV-HUC-1細胞生長良好（圖3）。

通過以上實驗，證實了SV-HUC-1細胞能夠正常生長傳代20代，形態正常，能夠表達泌尿系上皮細胞的標志蛋白，并能以活細胞的方式進行示蹤和觀察。

3 討論

國內外有許多有關組織工程化尿道的研究，直接取自人體或動物的成體膀胱黏膜上皮細胞及尿道黏膜上皮細胞等泌尿系統上皮細胞是常用的種子細胞[1-8]，也有選用表皮細胞者[9-10]。

來自泌尿系統的上皮細胞無疑是最適用于尿道組織工程的種子細胞，但是由于直接取自人體或動物的成體泌尿系上皮細胞在經歷若干代傳代之后往往其性質發生較大變化，所以雖然個別作者報道能夠在較短時間內獲得大量擴增的尿道黏膜上皮細胞用于組織工程化器官構建[11]，但是大多數國內外在應用直接取自人體或動物的成體細胞作為種子細胞的進行研究時，其傳代多為10代以內[1-10]。

但是，有很多實驗需要大量的細胞進行研究，需要進行大量傳代而獲得大量細胞；另有很多研究目的不在于種子細胞，而是集中注意力于組織工程種子細胞與材料的復合方面的研究，因此就需要找到一種可以反復傳代而不發生變性的尿道黏膜上皮種子細胞，這是能夠保證很多實驗順利進行下去的前提。因此有必要尋找一種能繞過成體細胞難以大量傳代的障礙，繞過種子細胞對于實驗過程的干擾的方法。

如何解決這個問題呢？筆者考慮到應用SV-HUC-1細胞系，這種細胞來源于泌尿系上皮細胞，其特點在于能夠無限傳代下去。但是多次傳代后SV-HUC-1細胞能夠保持其原有性質嗎？還適用于進行實驗研究嗎？本實驗對于第20代SV-HUC-1細胞，應用倒置相差顯微鏡觀察生長到其形態正常。并檢測了第20代SV-HUC-1細胞的標志蛋白表達。應用RT-PCR法和間接免疫熒光法均檢測到第20代SV-HUC-1細胞中Vimentin和CK-18的mRNA表達。應用研究活細胞示蹤研究，在第20代SV-HUC-1細胞中加入活細胞示蹤劑Cell Tracker? Blue CMF2HC后，以熒光顯微鏡觀察細胞的生長情況，發現SV-HUC-1細胞生長良好。

通過以上實驗，證實了SV-HUC-1細胞能夠正常生長傳代20代，形態正常，能夠表達泌尿系上皮細胞的標志蛋白，并能以活細胞的方式進行示蹤和觀察。從這一角度為說，SV-HUC-1細胞系是適合作為尿道組織工程實驗用的種子細胞。

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[收稿日期]2011-09-25 [修回日期]2012-02-17

編輯/張惠娟