富血小板纖維蛋白體外釋放VEGF影響因素的探討

[摘要]目的：探討不同材質(zhì)的離心管和儲存溫度對制備的富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）釋放血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的影響。方法：分別用玻璃離心管和塑料離心管從健康家兔耳中動脈采血制備PRF，制備成PRF膜片后，加入無菌DMEM培養(yǎng)液各分為兩組置于37℃和4℃條件下，并分別從 20min，4h，24h，72h，120h， 168h，0～168h七個時間點收集PRF樣本，用ELISA試劑盒檢測各時間點VEGF的含量情況。結(jié)果：4℃條件下保存的PRF膜片釋放VEGF含量高于37℃，玻璃離心管制備的PRF釋放的VEGF含量高于塑料離心管。結(jié)論：不同的材質(zhì)離心管和不同的儲藏溫度對PRF的特性存在一定影響，PRF的制備宜用玻璃離心管，在使用前宜儲藏于4℃條件下。

[關(guān)鍵詞]PRF；VEGF；溫度；材質(zhì)

[中圖分類號]R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）03-0427-04

Investigation of production and influential factors of platelet-rich fibrin

LI Long1，ZHAO Jian-hui2，LIU Bin3，LING HU Da-ke1，LIU Yan-pu1，LIANG Li-hua1，YANG Yong1， YANG Tao1

(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery， School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China; 2.Institute of Plastic Surgery，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032， Shaanxi，China; 3.Department of Oral Biology and Laboratory Animal Center，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract: Objective To investigate the influence factors of platelet-rich fibrin (PRF) releasing vascular endothelial growth factor (VEGF) with two different kinds of collection tubes (dry glass tubes and plastic tubes) and with different storage temperature (4 degree and 37degree). Methods PRF was produced with two different kinds of collection tubes(dry glass tubes and plastic tubes) from healthy rabbit's medium-sized artery of the ears， and saved in different storage temperature (4 degree and 37degree ) to test the quantity of released VEGF，and it was tested at seven experimental times: 20 min， 4 h， 24 h (day 1)，72h (day 3)，120 h (day 5) and 168 h (day 7)，0-168h(7days) with ELISA kit. Results The total quantity of VEGF with dry glass tubes was higher than that with plastic tubes， in the temperature group it showed that the total quantity of VEGF saved in 4 degree was higher than in the 37 degree. Conclusion Different kinds of collection tubes and different storage temperatures may affect the characteristics of PRF.The production of PRF should use dry glass tubes and PRF should be saved at 4 degree before it was used.

Key words:PRF;VEGF;temperature;texture

PRF自2001在法國被Choukroun[1]發(fā)現(xiàn)以來，引起了極大的研究興趣。由于其制作方法簡便、成本低廉，且未添加任何的抗凝劑或生物因子，其特性更接近天然的纖維蛋白基質(zhì)材料，PRF被認(rèn)為是第二代的血小板制品[2]。目前PRF應(yīng)用在較大口腔拔牙創(chuàng)的種植修復(fù)[3]和上頜竇底提升術(shù)促骨缺損修復(fù)[4]，以及促進(jìn)自體骨組織移植應(yīng)用[5]等方面已初步取得較顯著的效果。因其特殊的三維結(jié)構(gòu)和豐富而復(fù)雜的生長因子構(gòu)成體系[6]，國內(nèi)外文獻(xiàn)對其復(fù)雜的生物學(xué)特性和進(jìn)一步的臨床應(yīng)用價值尚未能形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。目前有研究表明PRF能釋放多種生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming Growth Factor b-1，TGFb-1)， 血小板衍生的生長因子(platelet derived growth factor AB， PDGF-AB)；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，凝血酶敏感素(thrombospondin-1， TSP-1)等[7]，PRF在目前的各種臨床應(yīng)用和實驗研究中所參與的相關(guān)作用機(jī)理和特性尚不明確。由于PRF在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合及血管生成方面具有獨(dú)特作用，而VEGF在血管生成方面也發(fā)揮重要的作用，因此本研究從PRF的制作方法和制備后保存于不同溫度對其的釋放VEGF相關(guān)特性影響入手，探討PRF相關(guān)特性的特點規(guī)律，進(jìn)一步加深對PRF的相關(guān)生物學(xué)特性的認(rèn)識，提高其在組織再生與創(chuàng)傷修復(fù)等領(lǐng)域的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1實驗動物：6月齡家兔10只，雌雄不限，體重約3～4 kg，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供（動物合格證：SCXK-(軍)2007-007：0034437）

1.2實驗材料：玻璃離心管（Hyclone），塑料離心管（Hyclone），DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)，兔血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司），臺式低速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司TDZ5-WS），水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司 DPX-9082B-2），酶聯(lián)免疫檢測儀（TECAN GENIOS公司）

1.3 方法

1.3.1 PRF制備

采血：取6月齡家兔，體重約3～4 kg，將未經(jīng)麻醉的家兔固定后呈倒立位，分別從十只家兔耳中動脈迅速采血約20ml，用塑料和玻璃離心管分別收集血液，立刻在3000r/min條件下，離心10min[1]，見圖1，離心后管內(nèi)成分分為三層，最上一層為PRF上清液，中間一層為PRF凝膠，最下一層為紅細(xì)胞層，玻璃管分層比較明顯，而塑料離心管PRF上清不甚明顯，見圖2。從管內(nèi)取出PRF凝膠后剪去底層紅色部分，用雙層無菌紗布擠壓吸去多余液體[1]，制備成PRF膜片圖3。

1.3.2 PRF釋放VEGF樣本收集：根據(jù)PRF不同的影響因素（材質(zhì)和溫度），將PRF膜片分別置于37℃和4℃并于七個不同時間點分別收集樣本[7]，即20min，4h，24h (day1)，72h (day3)，120h (day5)，and 168h (day7)，0-7day。

1.3.2.1 PRF上清液收集：制備PRF膜片前，先用5ml無菌的一次性注射器將各組PRF上清液收集到10ml無菌離心管內(nèi)，并保存于-20℃冰箱內(nèi)待測。

1.3.2.2 PRF膜片釋放VEGF標(biāo)本收集：PRF膜片分別置于無菌離心管內(nèi)并加入4ml無菌DMEM培養(yǎng)液，然后在不同時間點，將每組PRF膜片轉(zhuǎn)移到新的離心管內(nèi)并加入4ml無菌DMEM培養(yǎng)液，并將之前管內(nèi)4mlDMEM培養(yǎng)液放入-20℃條件下保存待測[7]。

1.3.3 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒檢測及數(shù)據(jù)收集：將所收集的樣本按照ELISA試劑盒說明檢測，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm處測吸光值。根據(jù)樣品OD值用Curve Expert 1.4軟件計算相應(yīng)VEGF含量，然后根據(jù)所檢測的VEGF濃度計算每個PRF膜片整個周期（0-168h）所釋放的VEGF總量，VEGF總量=各時間點濃度(pg/ml)總和×4，然后根據(jù)各組VEGF總量結(jié)果比較不同材質(zhì)和溫度制備的PRF對釋放VEGF的影響。

1.3.4 統(tǒng)計分析：采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。資料采用配對t檢驗比較兩組之間的差別，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 本實驗結(jié)果顯示PRF在整個周期中持續(xù)釋放VEGF，但每個時間點所釋放的VEGF的速度有所不同，前4h釋放的速度較快，4h～1天維持在較高水平，1～3天進(jìn)而放緩，3～5天釋放略顯緩慢，5～7天仍持續(xù)釋放但速度較慢且釋放的量較少，0～168h較低，見圖4。

2.2 玻璃管與塑料管制備PRF對釋放VEGF含量比較：實驗結(jié)果表明對于玻璃離心管制備的PRF，其持續(xù)一周釋放的VEGF含量高于塑料離心管制備的，見圖5，兩者比較有顯著統(tǒng)計意義（P<0.05）。

2.2 不同溫度對PRF釋放VEGF含量的比較：本實驗結(jié)果顯示保存于4℃的PRF膜片所釋放的VEGF含量高于保存在37℃的，兩者比較具有顯著統(tǒng)計意義（P<0.05）。

2.3 PRF上清液與PRF各時間點釋放VEGF含量比較：本實驗結(jié)果同樣顯示所制備的PRF上清液中，也含少量的VEGF，相對PRF各時間點所釋放的量略少，見圖7。

3 討論

3.1 目前國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報道中對PRF特性的研究尚不多見，尤其是對其制備方法和相關(guān)影響因素方面的研究。由于科研實驗或臨床中手術(shù)程序等原因，PRF在制備后一般未能即刻應(yīng)用，因此需要暫時儲存于合適條件下以待用。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中未見提及不同儲存溫度是否對PRF的特性存在一定影響，同時對于PRF的制備所用的離心管材質(zhì)是否對PRF特性有影響等方面的研究也尚未有詳細(xì)的相關(guān)報道，因此本研究通過采用不同材質(zhì)的離心管制備PRF和不同的儲藏溫度是否對PRF釋放相關(guān)生長因子存在影響方面入手，探討其相關(guān)生物學(xué)特性。

3.2 本實驗通過采用不同材質(zhì)的離心管制備PRF以及保存于不同溫度來檢測其對釋放VEGF的含量變化，其對VEGF釋放的總體規(guī)律與國外研究結(jié)果相符[7]，本實驗結(jié)果顯示PRF能持續(xù)釋放VEGF一周以上，但每個時間點所釋放的VEGF的速度有所不同，同時發(fā)現(xiàn)不同材質(zhì)的離心管和不同的保存溫度對PRF的生物學(xué)特性存在一定的影響，玻璃離心管制備的PRF以及保存于4℃的PRF所釋放的VEGF含量略高于塑料管制備的PRF以及保存于37℃的PRF，但這兩者存在差異的具體影響因素有待進(jìn)一步研究探討。因此在制備PRF之前應(yīng)采用合適的離心管和合適的保存溫度，以免影響相關(guān)生長因子的作用。本實驗中0～168h檢測的PRF含量相對較低，其可能原因是釋放的生長因子存在一定的衰減作用，因此也應(yīng)考慮PRF制備后的保存時間問題，PRF制備好之后不宜存放太長時間，若長時間不能馬上使用應(yīng)置于低溫保存，但具體的合適溫度和最佳使用時間有待進(jìn)一步研究。本實驗通過對PRF的上清液釋放VEGF的檢測中發(fā)現(xiàn)，PRF上清液也存在一定的相關(guān)生長因子，與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致[8]，其含量相對PRF膜片略顯偏低，但仍然具有一定的應(yīng)用價值，因此在臨床應(yīng)用或是基礎(chǔ)研究中不應(yīng)忽視。

3.3 PRF作為近年來的研究熱點，但對其相關(guān)特性和影響因素尚未明確，有研究表明PRF能促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖、分化和再生能力[9]等。目前PRF在口腔種植領(lǐng)域的應(yīng)用已初步取得成效[3-4]，有研究顯示PRF在口腔軟硬組織的創(chuàng)傷修復(fù)中，起到了較明顯的促進(jìn)作用[10-11]，同時Liao等[12]利用PRF復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于下頜骨的重建術(shù)表明，PRF作為新的二代富含血小板生物材料具有促進(jìn)骨再生的潛能。本課題組前期實驗中利用PRF和ASCs復(fù)合自體脂肪顆粒進(jìn)行的自體脂肪移植，結(jié)果也提示PRF能夠顯著提高移植脂肪組織的成活率，因此利用PRF復(fù)合相關(guān)基質(zhì)或干細(xì)胞在未來整形美容領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用前景和價值。本實驗通過采用不同材質(zhì)的離心管和不同的保存溫度比較PRF和PRF上清液釋放VEGF含量變化的特性，進(jìn)一步全面認(rèn)識PRF的相關(guān)生物學(xué)特性，為提高和推廣PRF在臨床的應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

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[收稿日期]2011-09-28 [修回日期]2011-11-24

編輯/張惠娟