節(jié)旋藻實時熒光定量PCR內參基因的選擇

摘 要:本實驗利用實時熒光定量PCR對極大節(jié)選藻中16SrRNA、TEF(翻譯延伸因子，GTPases)、RPL13(核糖體蛋白)、PSR(藻藍蛋白β亞基)、CYP(親環(huán)素家族)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、Hsp(熱休克蛋白)和rpoD(RNA聚合酶σ70 因子)八個候選基因在正常生長和持續(xù)光照條件下的穩(wěn)定性進行了檢測。用geNorm軟件對實驗數據進行處理，從中選出合適的內參基因。結果表明RPL13和CYP38可以作為正常生長和持續(xù)光照處理下極大節(jié)選藻節(jié)律性研究通用的內參基因16SrRNA基因的穩(wěn)定性要低于其他的候選內參基因，并不是一個合適的內參基因。

關鍵詞:節(jié)旋藻 內參基因 實時熒光定量PCR geNorm 生物節(jié)律

中圖分類號:Q78文獻標識碼:A文章編號:1672-3791(2012)06(c)-0102-01

用實時熒光定量PCR進行相對定量時，需選取在不同實驗條件下表達恒定的基因作為內參對目標基因的表達量進行校正。常用的內參基因有GAPDH、β-actin、18SRNA、16SRNA、RPL13、Cyclophilin等，然而近年來的研究發(fā)現常用的內參基因存在一些缺陷。Revillion等[1]發(fā)現GAPDH mRNA在不同癌組織、不同個體間以及細胞周期的不同階段變化較大。18SrRNA和16SrRNA作為內參也遭到了質疑。Tricarico等[2]認為對于已純化mRNA中的目標基因進行定量時，rRNA不能用于標準化;相對于大部分目標基因，rRNA的表達量太高，不能真實的反映目標基因的降解情況。

1 材料與方法

將節(jié)旋藻Arthrospira FACHB 438于Zarrouk液體培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)至對數期。培養(yǎng)條件為23℃恒溫，光強30μmol·m-2·s-1，12L/12D培養(yǎng)。藻液黑暗處理12h以達到同步化后，分別進行持續(xù)光照處理和正常培養(yǎng)。每隔4小時收一次藻，收集48小時，共得到26個樣品組，兩種實驗條件下各13個。材料用上海飛捷公司RNAfast200提取試劑盒提取總RNA，用1%的瓊脂糖電泳檢測質量;用微量定量儀測定濃度和純度。取800ng消化后的總RNA加100prmol的六堿基隨機引物，按照反轉錄操作流程合成cDNA。根據候選內參基因序列設計引物，使PCR擴增效率(E)在95%到110%之間。

q-rt-PCR在ABI 7500 Real-time PCR Systerm上進行。反應體系按照試劑說明配制。實驗過程分八次熒光定量PCR反應進行，每次檢測一個基因，每個基因的檢測包括每個樣品中此基因的熒光定量PCR和標準曲線的繪制?；虻臉藴是€是用極大節(jié)旋藻FACHB438的基因組DNA為模板，稀釋10、102、103、104、105、106、107倍7個濃度梯度，然后以模板稀釋倍數的對數值為橫軸，平均Ct值為縱軸做標準曲線。用geNorm軟件篩選內參基因時首先樣品Ct值利用2-△Ct法轉化成基因表達量值Q，具體做法如下[3]:將同一基因所有樣品中Ct值最小的樣品Q值設為1，同一基因其余樣品的Q值用下面兩式計算:Q=EdeltaCt(1)，deltaCt=minCt-sampleCt(2)。其中E為擴增效率，可通過標準曲線斜率計算得到，公式為:E=10-1/斜率。GeNorm程序將量值Q作為輸入文件，把某一看家基因與其他看家基因的表達量值進行兩兩比對，然后將得到的比值經過對數變換，再計算這些對數值的標準差，并以此作為這個基因的表達穩(wěn)定性M。M值越高，說明該基因的穩(wěn)定性越差;M值越低，說明該基因的穩(wěn)定性越好。

2 結果與討論

研究發(fā)現，使用單一內參基因比使用2個或以上數目的內參基因引起的誤差高3～6.4倍。GeNorm篩選出2個以上的內參基因。在正常生長組，平均M值最低即表達穩(wěn)定性最好的兩個基因為CYP和RPL13，M值分別為1.50和1.45，16SrRNA的M值高達1.883在光照處理組，平均M值最低即表達穩(wěn)定性最好的兩個基因也為CYP和RPL13，M值分別為1.379和1.528，16SrRNA基因的M值高達2.195。16SrRNA在光照處理組和正常生長組相比于CYP和RPL13均未表現出較好的表達穩(wěn)定性，也意味著16SrRNA并不是一個合適的內參基因。

藍藻作為地球上最古老的物種之一，具有重要的研究價值。目前針對藍藻的研究主要集中在其耐鹽機制、耐堿機制以及藍藻高效的CO2利用率。其中16S rRNA被默認為在所有實驗條件下的表達量都是穩(wěn)定的。但本研究發(fā)現16S rRNA的穩(wěn)定性都比較差。在GeNorm分析中，GAPDH、16S rRNA和Hsp基因的M值最高，表明它們不適合作為內參;光照處理組中基于平均M值分析，表達穩(wěn)定性最高的是CYP和RPL13基因，在正常生長組，基于平均M值分析，表達最穩(wěn)定的基因是RPL13和CYP基因。RPL13基因良好的穩(wěn)定性在真核生物部分生物的研究中已經得到證實。CYP基因是親環(huán)素家族一員，它在節(jié)旋藻光系統(tǒng)Ⅱ中起關鍵作用，而且它在環(huán)境脅迫下的馬鈴薯中具有很好的表達穩(wěn)定性。

參考文獻

[1]Revilion F，et al.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene expression in human breast cancer [J]. Eur J Cancer，2000，36(8):1038～1042.

[2]Tricarico C，et al Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction:normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies [J]. Analytical Biochemistry，2002，309(2):293～300.

[3]Vandesompele J et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol，2002 3:7.