PI3K/Akt抑制劑聯(lián)合西妥昔單抗對人肺癌細(xì)胞的體外抑制作用

[摘要] 目的 探討PI3K/Akt抑制劑LY294002單獨(dú)或聯(lián)合西妥昔單抗對人肺癌細(xì)胞株A549的作用，以期為肺癌臨床治療方案的選擇、用藥順序提供新的理論依據(jù)。 方法 選用西妥昔單抗和LY294002，分析單藥及不同濃度和聯(lián)合作用方式對A549細(xì)胞增殖的影響；計(jì)算IC50值和CI值，分析藥物聯(lián)合作用的效應(yīng)是協(xié)同、相加抑或拮抗。 結(jié)果 單獨(dú)作用時(shí)，西妥昔單抗與LY294002最大抑制率分別為（57.3±6.2）%、（56.2±6.0）%；聯(lián)合作用時(shí)，LY294002→西妥昔單抗序貫給藥（CI = 0.41）比同步應(yīng)用（CI = 0.73）可增強(qiáng)療效，其最大抑制率分別為（84.9±7.5）%和（79.0±7.3）%。 結(jié)論兩藥對A549細(xì)胞增殖均具有抑制作用，LY294002→西妥昔單抗序貫聯(lián)合應(yīng)用對A549細(xì)胞的增殖抑制率最高。

[關(guān)鍵詞] 肺癌細(xì)胞株；磷脂酰肌醇—3—激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶；LY294002；西妥昔單抗

[中圖分類號] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673—9701（2012）27—0006—03

Effects of cetuximab combined inhibitor of PI3K/Akt on proliferation of human lung carcinoma cell lines A549

SHEN Hui

Department of Respiratory Medicine，Huzhou Central Hospital in Zhejiang Province，Huzhou 313000，China

[Abstract] Objective To evaluate the effects of cetuximab and inhibitor of phosphatidylinositol 3—kinase/Akt（PI3K/Akt） LY294002 on proliferation of non—small cell lung cancer （NSCLC） lines A549 alone and in different sequences of combinations. Methods Cetuximaband LY294002， alone or in combination were administrated to A549 cells with different sequences. The IC50 and the combination index（CI） of these two agents were calculated. Results The single agent of cetuximab and LY294002 inhibited the proliferation of A549 cells in a dose—dependent manner. The proliferation inhibition rates of A549 cells were （57.3±6.2）% and （56.2±6.0）%. When cetuximab was combined with LY294002 synchronously，the maximal inhibitory effect of the proliferation inhibition rate of A549 was （79.0±7.3）%. At that time，the CI of the two agents at IC50 points was 0.73，suggested that they had obvious synergistic activity. While，when LY294002 was followed by cetuximab，the maximal inhibitory effect of the proliferation inhibition rate of A549 was （84.9±7.5）% and the CI of the two agents at IC50 points was 0.41. Conclusion The single agent of cetuximab and LY294002 can inhibit the proliferation of A549 cells，and they have obvious synergistic activity. The optimal treatment sequence is LY294002 followed by cetuximab，and it can obtain obvious synergistic activity and conduce to less doses in clinical application.

[Key words] Lung cancer cell lines； PI3K/Akt； LY294002； Cetuximab

肺癌是當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤，發(fā)病率在多數(shù)國家呈明顯上升趨勢，全球每年有超過100萬人死于肺癌，其中約85%死于非小細(xì)胞肺癌（non—small cell lung cancer，NSCLC）[1]。世界衛(wèi)生組織報(bào)告肺癌和艾滋病將是21世紀(jì)危害人類健康最嚴(yán)重的疾病。目前針對NSCLC的治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療等。化療雖然能改善NSCLC患者的生存率，然而5年存活率僅為15%[2]。因此，進(jìn)一步研究肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找針對肺癌的靶向治療手段是非常必要的。近年有關(guān)磷脂酰肌醇—3—激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在控制基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和凋亡等生理功能方面的研究引起了人們的重視。Akt的過度激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且大多數(shù)NSCLC患者的Akt表達(dá)明顯升高，說明PI3K/Akt信號通路對于NSCLC的發(fā)生發(fā)展有重要的影響[3，4]。PI3K/Akt抑制劑LY294002 [2—（4—嗎啉基）—8—苯基—4氫—1—苯并吡喃—4—酮]可增強(qiáng)某些抗腫瘤藥物的療效，減少化療抵抗[5，6]。但是，LY294002對肺癌的研究尚不多見，尤其是LY294002與西妥昔單抗（Cetuximab，C—225）聯(lián)合應(yīng)用對人肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用是否存在協(xié)同作用及不同聯(lián)合作用方式對抑制作用的影響等研究目前仍無文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Cetuximab與PI3K/Akt抑制劑LY294002均購自德國默克制藥公司，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、10%新生小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的雙抗、0.25%胰酶溶液購自美國Gibco公司，分析純二甲基亞砜（DMSO）和3—（4，5—二甲基噻唑—2）—2，5—二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株A549購自中科院上海細(xì)胞所，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、85%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4天傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 單藥對細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn) 設(shè)空白對照組、細(xì)胞對照組和單藥實(shí)驗(yàn)組；單藥實(shí)驗(yàn)組即Cetuximab處理組和LY294002處理組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶溶液充分消化后，用DMEM培養(yǎng)液稀釋成單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為3×104/mL，置于恒溫箱中培養(yǎng)。兩藥單用時(shí)各選取5個(gè)依次遞增的濃度（1、5、25、125、625 nmol/L Cetuximab，5、10、20、40、80 μmol/L LY294002）處理細(xì)胞，分別培養(yǎng)48 h。之后每孔加入5 mg/mL MTT液20 μL，37℃、5%CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去孔內(nèi)上清，每孔加150 μL DMSO，震蕩10 min使沉淀充分溶解，酶標(biāo)儀570 nm波長下測定吸光度OD值（A），并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 兩藥不同聯(lián)合方式對細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn) 設(shè)空白對照組、細(xì)胞對照組和聯(lián)合實(shí)驗(yàn)組；聯(lián)合實(shí)驗(yàn)組包括：LY294002和Cetuximab同步聯(lián)合處理組（即LY294002+C—225），Cetuximab→LY294002序貫處理組（即C—225→LY294002），LY294002→Cetuximab序貫處理組（即LY294002→C—225），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)單藥在1.2.2中獲得的IC50值，確定兩藥聯(lián)用時(shí)的比例和濃度。分別采用組合濃度的1/10、1/5、1、2、5倍作用于細(xì)胞，加入孔內(nèi)的藥物濃度遞增的同時(shí)兩藥間濃度比例保持恒定。之后同1.2.2所述，經(jīng)MTT檢測后應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值（A值），并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ①各組細(xì)胞存活率（%）=（該藥物處理組A值—空白對照組A值）/（細(xì)胞對照組A值—空白對照組A值）×100%；②細(xì)胞增殖抑制率（%）=100%—該組細(xì)胞存活率。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理根據(jù)Chou等藥物協(xié)同作用中效原理[7]，使用SPSS 13.0軟件計(jì)算Cetuximab和LY294002在單獨(dú)、同步聯(lián)用和不同序貫方式聯(lián)用時(shí)對A549細(xì)胞的IC50值（50% inhibition concentration，半數(shù)抑制濃度）。根據(jù)IC50值計(jì)算協(xié)同系數(shù)（combination index，CI）。CI值是評價(jià)兩種藥物之間相互作用的指標(biāo)，特別是兩藥各自在IC50時(shí)的CI值，是衡量其相互作用的性質(zhì)和強(qiáng)度的客觀指標(biāo)。CI=D1/Dx1+D2/Dx2+αD1D2/ Dx1 Dx2，其中D1、D2為兩藥合用時(shí)產(chǎn)生x效應(yīng)時(shí)兩藥各自所需濃度，Dx1、Dx2為兩藥單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生x效應(yīng)時(shí)兩藥各自濃度。α=0為兩種相互排斥性藥物，α=1為兩種相互非排除性藥物。兩藥聯(lián)用時(shí)CI>1為拮抗，CI=1為相加，CI<1為協(xié)同，CI值越小，協(xié)同效應(yīng)越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 單藥Cetuximab對A549細(xì)胞的作用

單藥Cetuximab對A549細(xì)胞有明顯抑制作用，且呈顯著的濃度依賴性，隨藥物濃度增加其抑制作用也顯著增強(qiáng)，作用48 h最大抑制率達(dá)（57.3±6.2）%，見表1。作用48 h的IC50值為187.20 nmol/L。

2.2 單藥LY294002對A549細(xì)胞的作用

單藥LY294002對A549細(xì)胞增殖的抑制作用呈明顯的濃度依賴性，作用48 h后其最大抑制率達(dá)（56.2±6.0）%，見表1。作用48 h的IC50值為47.13 μmol/L。

2.3 LY294002和Cetuximab同步聯(lián)合組對A549細(xì)胞的作用

根據(jù)LY294002和Cetuximab在單獨(dú)處理48 h時(shí)的IC50分別為47.13 μmol/L和187.20 nmol/L，聯(lián)合組中兩藥聯(lián)用時(shí)的比例為1∶4（即47.13 μmol/L LY294002和187.20 nmol/L Cetuximab聯(lián)用）。分別采用組合濃度的1/10、1/5、1、2、5倍同步聯(lián)合作用于A549細(xì)胞48 h后，對細(xì)胞的增殖抑制率較單藥略有升高，其最大抑制率達(dá)（79.0±7.3）%（940 nmol/L Cetuximab，235 μmol/L LY294002）。見表2。Cetuximab和LY294002同步聯(lián)合作用時(shí)IC50的濃度分別為59.50 nmol/L和14.88 μmol/L，此時(shí)CI值為0.73，說明兩藥同步聯(lián)用表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)。

2.4 Cetuximab→LY294002序貫處理組對A549細(xì)胞的作用

Cetuximab處理48 h后，LY294002再處理48 h的序貫處理組不同濃度對應(yīng)的細(xì)胞增殖抑制率如表2，在5倍濃度時(shí)其最大抑制率達(dá)（76.7±7.0）%（表2）。且Cetuximab和LY294002的IC50的濃度分別為69.69 nmol/L和17.42 μmol/L，此時(shí)CI值為0.88，說明Cetuximab→LY294002序貫處理表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，且協(xié)同效應(yīng)近似于兩藥同步聯(lián)用。

2.5 LY294002→Cetuximab序貫處理組對A549細(xì)胞的作用

LY294002處理48 h后，Cetuximab再處理48 h的序貫處理組不同濃度對應(yīng)的細(xì)胞增殖抑制率如表2，在5倍濃度時(shí)其最大抑制率達(dá)（84.9±7.5）%（表2）。LY294002和Cetuximab的IC50的濃度分別為8.84 μmol/L和35.37 nmol/L，此時(shí)CI值為0.41，說明LY294002→Cetuximab序貫處理表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，且協(xié)同效應(yīng)高于LY294002和Cetuximab同步聯(lián)合組和Cetuximab→LY294002序貫處理組。

表2 LY294002和Cetuximab不同聯(lián)用方式對A549細(xì)胞的作用

3 討論

PI3K/Akt通路被認(rèn)為是癌細(xì)胞存活的首要通路，有“抗凋亡途徑”之稱。該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常，可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖引起腫瘤[8]。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，與v—src和v—ras等癌基因的產(chǎn)物相關(guān)，PI3K介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化、凋亡等活動(dòng)[9]。Akt是PI3K下游直接的靶蛋白，其具有絲氨酸/蘇氨酸殘基，可直接被PI3K激活，也可以被PI3K激活的PDK1和PDK2所激活。p—Akt是Akt的功能活化狀態(tài)，Akt 只有在活化狀態(tài)時(shí)才具有生物學(xué)功能[10]。p—Akt在大多數(shù)腫瘤組織中過度表達(dá)，在非小細(xì)胞肺癌患者中發(fā)現(xiàn)p—Akt總表達(dá)率為67.4%，在鱗癌和腺癌中的表達(dá)率分別為68.2%和61.5%，因此PI3K/Akt通路可能是參與肺癌發(fā)生發(fā)展的重要途徑[11]。

腫瘤細(xì)胞可以通過對負(fù)責(zé)細(xì)胞生長和凋亡的細(xì)胞信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)控（如Akt通路的激活）而獲得對化療藥物的抵抗力。Akt是抑制細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)凋亡化療藥物敏感性的中樞介質(zhì)。PI3K /Akt通路的激活已被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞抗凋亡的主要機(jī)制之一，因此抑制P13K可作為抑制腫瘤生長的一種新思路。LY294002是五羥黃酮的衍生物，能完全特異性地抑制PI3K活性，能和PI3K 競爭性結(jié)合ATP位點(diǎn)， 抑制Akt的激活。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LY294002對結(jié)腸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞等有抑制生長、促進(jìn)凋亡作用[12—15]。本研究發(fā)現(xiàn)LY294002 可抑制A549 細(xì)胞增殖， 且隨著LY294002濃度的增大生長抑制率也隨之增大，說明通過抑制PI3K/Akt基因的表達(dá)從而調(diào)整細(xì)胞增殖與凋亡間的平衡，可能是肺癌靶向治療的新思路。

EGFR是生長因子家族的重要成員之一，廣泛分布于人體正常肝細(xì)胞、胃腸黏膜上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等表面[16]。EGFR與配體EGF等結(jié)合后，自身磷酸化而激活，并啟動(dòng)下游一系列級聯(lián)酶促信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最重要的通路之一就是PI3K/Akt通路[17]。惡性腫瘤發(fā)病原因復(fù)雜，是一種由多因素通過復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)相互作用所致的疾病，因此多靶點(diǎn)抑制在惡性腫瘤治療方面優(yōu)于單靶點(diǎn)抑制，多靶點(diǎn)聯(lián)合阻斷信號傳導(dǎo)是腫瘤治療和藥物開發(fā)新的發(fā)展方向。由于EGFR在PI3K/Akt通路中起著重要作用，因此，我們認(rèn)為EGFR抑制劑與PI3K/Akt抑制劑的聯(lián)用可能會為肺癌的靶向治療提供新的思路。西妥昔單抗是一種人—鼠嵌合抗EGFR IgG1 MAb，屬于作用于胞外區(qū)的單克隆抗體，可以阻斷EGF和TGF—α與EGFR的結(jié)合。體外實(shí)驗(yàn)表明，C—225能抑制人NSCLC細(xì)胞株的生長，與細(xì)胞毒藥物如順鉑或與放療聯(lián)合有協(xié)同抑制作用[18]。

我們的研究結(jié)果表明，EGFR抑制劑Cetuximab和PI3K/Akt抑制劑LY294002同步聯(lián)用時(shí)，IC50值低于單用時(shí)的IC50值，CI值<1（CI=0.73）。Cetuximab→LY294002序貫處理組中兩藥IC50值與同步聯(lián)用時(shí)的IC50值接近，CI值<1（CI=0.88），略大于同步聯(lián)用時(shí)的CI值。LY294002→Cetuximab序貫處理組中兩藥IC50值低于單用、同步聯(lián)用和Cetuximab→LY294002序貫處理組的IC50值，且CI值<1（CI=0.41）。根據(jù)Chou等藥物量效原理：兩藥聯(lián)用時(shí)CI>1為拮抗，CI=1為相加，CI<1為協(xié)同，CI值越小，協(xié)同效應(yīng)越強(qiáng)，說明Cetuximab與LY294002同步聯(lián)用和以不同順序序貫聯(lián)用時(shí)均表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，且以給藥序貫為LY294002先于Cetuximab給藥時(shí)兩者的協(xié)同效應(yīng)最為明顯（CI=0.41）。西妥昔單抗和LY294002聯(lián)合應(yīng)用時(shí)二者具有明顯的協(xié)同效應(yīng)的分子機(jī)制可能是LY294002在西妥昔單抗抑制EGFR信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步下調(diào)了EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游PI3K/Akt通路中關(guān)鍵酶PI3K和Akt的表達(dá)，兩藥聯(lián)用從上游和下游兩個(gè)層次上阻斷EGFR的活化，從而協(xié)同抑制了EGFR對A549細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，但二藥不同序貫順序影響協(xié)同作用效果的詳細(xì)分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

總之，本文通過體外研究發(fā)現(xiàn)Cetuximab與LY294002聯(lián)用能顯著增強(qiáng)兩藥對人肺癌細(xì)胞A549的增殖抑制作用，并明確了合理的藥物組合和用藥方式，為臨床肺癌治療中方案的選擇和聯(lián)合用藥方式提供一定的理論參考。

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（收稿日期：2012—05—02）