咽喉清口含片HPLC特征圖譜質量控制方法研究

李文周，李一圣，陳艷艷，胡文會，肖增麗，范曉梅，邱書奇

(1.深圳市龍崗區耳鼻咽喉醫院，廣東 深圳 518116；2.深圳市耳鼻咽喉研究所，廣東 深圳 518116； 3.暨南大學附屬深圳市寶安區婦幼保健院，廣東 深圳 518133)

咽喉清口含片是由金銀花、玄參、青果和胖大海等十多味藥材組成的中藥制劑，具有清熱解毒、化痰利咽的功能，臨床上用于外感風熱型急性咽炎的治療，療效確切[1]。目前，該制劑主要通過薄層鑒別及綠原酸含量測定來控制產品質量。然而，咽喉清口含片組方藥味較多，制備工藝過程中各藥味采用分組處理方式，藥效物質基礎復雜，僅以單一成分的含量為指標進行質量控制存在明顯不足，未能全面有效的控制該制劑的綜合質量，已不能滿足日益嚴格的藥品質量控制要求。因此，我們開展咽喉清口含片的色譜特征圖譜研究，并擬將其應用至該制劑的質量標準中，以期更好的對其質量均一性和穩定性進行控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695/2998高效液相色譜儀，Empower 3色譜工作站，國家藥典委員會中藥色譜特征圖譜相似度評價系統(2012版)，KQ3200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；分析天平(Sartorius BT 25s、Sartorius BSA124s)。

綠原酸對照品(批號：110753-201314)、次野鳶尾黃素對照品(批號：111557-200602)均購于中國食品藥品檢定研究院，甲醇、乙腈為色譜級。咽喉清口含片10批為深圳市龍崗區耳鼻咽喉醫院院內制劑，由廣東五虎山藥業有限公司生產，樣品批次見表1。

表1 10批咽喉清口含片樣品列表

2 方法與結果

2.1 色譜條件 固定相為Waters Symmetry C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液，梯度洗脫，0～5 min：乙腈13%，5～28 min:乙腈13%～57%，28～28.01 min：乙腈57%～13%，28.01～35 min:乙腈13%；檢測波長為260 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 取咽喉清口含片，除去包衣，研細，精密稱取1.5 g，加入甲醇30 mL，超聲提取30 min(250 W，50 kHz)，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL完全轉移至分液漏斗中，加乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯層，合并，蒸干，加甲醇5 mL使溶解并稀釋至刻度，濾過，取續濾液，作為供試品溶液[2]。

2.2.2 對照品溶液制備 取綠原酸和次野鳶尾黃素適量，分別加甲醇制成每1 mL含綠原酸30 μg、含次野鳶尾黃素10 μg的對照品溶液[3]，濾過，取續濾液，即得。

2.3 測定法 精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，記錄35 min色譜圖。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度考察 取同一份供試品溶液(批號：1605101)，連續進樣6次，考察各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果各色譜峰的相對保留時間的RSD均小于0.26%，各色譜峰的相對峰面積的RSD均小于2.78%，表明儀器精密度符合特征圖譜技術要求。

2.4.2 穩定性試驗 取同一份供試品溶液(批號：1605101)，分別于0、2、4、8、12、24 h時進行測定，考察各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果各色譜峰的相對保留時間的RSD均小于0.35%，各色譜峰的相對峰面積的RSD均小于3.58%，表明供試品溶液在24 h內保持穩定，符合特征圖譜技術要求。

2.4.3 重復性試驗 取咽喉清口含片(批號：1605101)，按“2.2.1”項下所述方法制備成供試品溶液6份，按“2.3” 項下所述方法進行測定，考察各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果各色譜峰的相對保留時間的RSD均小于0.31%，各色譜峰的相對峰面積均小于4.72%，表明該方法具有良好的重現性，符合特征圖譜技術要求。

2.5 特征圖譜共有模式建立[4]取咽喉清口含片10批(見表1),分別制備供試品溶液，按上述“2.1”項下色譜條件進行高效液相色譜(HPLC)分析，記錄色譜圖，并導入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖相似度評價系統(2012版)”，經過多點矯正和數據匹配生成色譜特征圖譜共有模式，通過比對，確定20個共有特征峰，以對照品進行指認，確定其中5號峰為綠原酸，20號峰為次野鳶尾黃素。以綠原酸色譜峰為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間(各共有峰保留時間與綠原酸峰保留時間之比)及各批次樣品圖譜與標準圖譜的相似度(由相似度評價系統計算導出)。結果10批咽喉清口含片的HPLC色譜圖如圖1所示，其中R為共有模式標準圖譜。各特征峰的相對保留時間見表2，相似度計算結果見表3所示。

結果顯示，10批咽喉清口含片樣品圖譜與標準圖譜(見圖2)對比，其相似度均不低于0.97，表明該方法穩定可靠，可應用于該制劑的質量控制。根據試驗結果，所有被測試的供試品圖譜，均應有20個特征峰，且各特征峰的相對保留時間應如表2所示。

圖1 10批咽喉清口含片的HPLC色譜圖及其共有模式圖譜

圖2 咽喉清口含片HPLC標準特征圖譜及共有峰

表2 咽喉清口含片特征圖譜中各共有特征峰的相對保留時間表

表3 10批樣品圖譜與標準圖譜相似度

3 討論

3.1 相對于化學藥品成分組成的清晰明了，中藥復方制劑成分復雜難明，以單一成分為指標對中藥制劑進行質量控制的方法，常在科學性和合理性方面受到質疑，為此業界也在不斷探索更加合理的質量控制方法，其中，色譜特征圖譜質控技術作為一種能更好體現中藥成分整體性的技術手段，近年來在中藥制劑質量標準中的應用越見廣泛[5]。咽喉清口含片處方由十多味中藥組成，在制備時，考慮到各藥味的不同性質，采用了分組處理工藝，金銀花、玄參和青果等采用水提工藝，而射干、山豆根和錦燈籠等采用醇提工藝。分組處理工藝兼顧了組方藥味各自所含有效成分的特點，同時也對其質量控制方法提出了更高的要求，尤其是在制劑制備過程的控制上，如何有效控制不同處理組中間產物的質量，是我們必須重點考慮的問題。

咽喉清口含片此前的質量標準主要依賴多味藥材的薄層鑒別和綠原酸的含量測定，這顯然無法滿足我們對該制劑的質量控制要求。該標準中，綠原酸為處方中君藥金銀花的主要有效成分，其含量測定結果可一定程度上反映水提組工藝和質量情況，但醇提組的相關情況則為監控盲點，那么是否再建立一個指標成分的含量測定方法？或者還有更合理的解決方案？基于此考慮，我們建立咽喉清口含片色譜特征圖譜質控方法，并將其增補至制劑和中間品的內控標準中，應用于制劑制備的全過程控制，以期更好的保證所生產制劑質量的一致性和均一性。初步試驗結果表明，該方法合理可行，其有效應用，可獲得良好效果。

3.2 必須指出，本試驗僅使用連續生產的10批產品進行研究測試，樣本量較少，考察仍然不夠充分。限于客觀條件，咽喉清口含片雖已獲得國家中藥六類新藥臨床批件，并完成臨床試驗，但現階段仍然僅為醫療機構制劑，生產批次不多，隨著后續生產批次的不斷增多，所建立的圖譜仍需不斷進行驗證完善。

3.3 本試驗初步以綠原酸和次野鳶尾黃素對照品進行色譜峰的指認，其中綠原酸為處方中君藥金銀花的主要有效成分，次野鳶尾黃素則為射干中主要有效成分之一[6]。兩種成分可分別在一定程度上反映水提組藥味和醇提組藥味的工藝和質量情況，初步驗證所建立的特征圖譜質控方法。后續的試驗中，考慮進一步進行多色譜峰歸屬指認，再分別于細胞水平和動物水平上，開展基于抗炎抗氧化作用的譜效關系探討[7-9]，以揭示咽喉清口含片的組方合理性和組分作用機制。

3.4 由于成分的復雜性，多數中藥制劑的HPLC特征圖譜洗脫時間較長，考慮到藥品生產過程中時間成本和有機試劑耗用量的節約，建立方法時，我們在保證色譜峰分離情況的基礎上，盡量縮短樣品進樣洗脫時間，控制整個過程的時長，以提高效率。當然，隨著色譜技術的進步，控制時長提高效率的方法已經有了更多選擇，如利用超高效液相色譜(UPLC)來進行分析等，但由于咽喉清口含片生產單位的條件限制，現階段乃至未來一段時期內，HPLC法仍然不可替代，因此我們只能盡量控制其洗脫時長。

3.5 試驗過程中，我們曾以綠原酸和次野鳶尾黃素綜合轉移率為指標，對供試品溶液制備方法進行考察，比較了甲醇提取后乙酸乙酯萃取和乙酸乙酯直接提取的效果，結果乙酸乙酯直接提取所制備的供試品溶液，色譜信息不夠豐富，部分色譜峰極小，不利于積分統計，因此確定先以甲醇提取后加乙酸乙酯進行萃取。在此基礎上又考察了提取溶劑(水、甲醇)、提取方式(超聲提取、加熱回流提取)、提取時間、萃取次數、萃取溶劑用量等條件，結果確定供試品溶液制備方法如正文所示。