少弱精子癥ICSI受精失敗后行補救性卵母細胞輔助激活成功妊娠1例

黃玉芳，楊麗娟，陳勝輝，劉淑娟，孫迎利

(南昌市生殖醫院，南昌 330000)

卵胞漿內單精子注射(ICSI)是指將精子直接注射入卵母細胞胞質內的輔助受精顯微操作技術，其在嚴重少精子癥、弱精子癥、畸精子癥，以及經皮附睪穿刺取精及睪丸穿刺取精的梗阻性無精子癥患者中得到了廣泛應用。ICSI技術為這些患者帶來了福音，該技術能夠顯著提高受精率，然而仍有少部分的ICSI周期會發生完全受精失敗或受精率極度低下的病例[1-2]。在輔助生殖技術中，激活卵母細胞是受精中的關鍵環節，是生殖醫學中的重要研究內容，受精失敗最主要原因就是未成功激活卵母細胞[2-5]。針對ICSI后次日原核觀察發現完全不受精或者低受精率的周期，目前各大中心并無好的解決方案，該周期基本無可用胚胎。關于補救性化學激活卵母細胞案例更是較少相關報道[6]。現將1例因男方少弱精子癥行ICSI，次日原核觀察發現受精失敗后進行卵母細胞輔助激活(AOA)獲得早期囊胚1枚且新鮮移植，成功順產1名健康男嬰的病例報道如下。

一、病例資料

患者夫婦女方27歲，男方28歲。夫婦二人于2014年生育1名健康女孩。之后女方2015年人工流產1次，2016年自然流產1次。近5年來一直未采取避孕措施，性生活正常規律，每周1～2次。女方曾于2018年行輸卵管造影(HSG)檢查，提示宮腔正常，左側輸卵管傘端阻塞粘連，右側輸卵管峽部阻塞。2019年患者夫婦因不孕癥來我院就診，行宮腹腔鏡探查術，術中診斷雙側輸卵管積水、女性盆腔粘連；術中行腹腔鏡雙側輸卵管切除術和宮腔粘連松解術，宮腔鏡探查未見明顯異常。女方平素月經規律，周期30 d，經期5 d，經量中色暗紅無痛經，無傳染病史。男方無傳染病史及手術史，亦無不良嗜好，男科檢查前列腺未見異常，雙側睪丸大小正常，陰莖及射精功能正常。精液檢查結果：精子濃度為2×106/ml、活動率為5%、前向運動精子率為2%、非前向運動精子率為3%，診斷為少弱精子癥。夫妻雙方染色體檢查均正常。

女方促排卵方案為改良超長方案，取卵當日共獲卵15枚，其中成熟卵母細胞10枚、未成熟卵母細胞5枚。男方于取卵當日手淫取精，精液液化后進行精液處理，精子濃度低，活動度差。卵母細胞脫顆粒孵育30 min后取成熟卵母細胞10枚行ICSI。ICSI過程中卵母細胞形態未見異常，其中2枚卵母細胞無彈性；挑選形態尚可、活動度好的精子制動后分別注入卵母細胞內，制動和注射過程均順利。次日觀察受精情況，10枚成熟卵母細胞中的2枚無彈性卵母細胞退化，其余8枚卵母細胞未見原核形成。告知患者后建議選擇AOA進行受精補救，患者同意補救性AOA措施并簽署知情同意書后，立刻行離子霉素(Ionomycin，Ion)化學激活。AOA具體操作步驟為：將未受精的卵母細胞置于含10 μmol/L Ion的取卵-胚胎處理液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)中避光處理10 min，經卵裂胚培養液(G1 Plus，Vitrolife，瑞典)洗滌5～6次，然后轉入卵裂胚培養液中繼續培養。第3天觀察發現8枚化學激活的卵母細胞共有7枚發生卵裂，其中3級2枚、4級2枚，發育緩慢3枚。7枚卵裂胚胎全部行囊胚培養，第5天獲得融合胚胎2枚，余退化；第6天2枚融合胚胎中的1枚退化，另1枚發育成早期囊胚。應患者要求進行新鮮移植。術前告知患者移植由AOA發育而來的囊胚可能存在的風險，患者簽署知情同意書并繼續要求新鮮移植。早期囊胚移植7 d后檢測患者血HCG為33.42 U/L，移植45 d后B超顯示單胎妊娠，胎心胎芽皆可見，最后于孕39+2周剖腹產下1名男嬰，體重4.2 kg，身長50 cm，查體未見異常。

二、討論

未成功激活卵母細胞是受精失敗的最主要原因[2-5]。Ca2+振蕩在AOA過程中起十分重要的介導作用[7]。目前Ca2+振蕩發生原理主要集中在受體控制學說和可溶性精子蛋白學說兩方面[8-9]。大量研究使用電激活、物理激活或化學激活等激活方法來增加AOA所需的Ca2+，以成功激活行ICSI后的卵母細胞[10]。現各大生殖中心主要使用化學激活法進行AOA[11-13]，因為化學激活劑易購買、質量易保證、操作方法簡單易學易開展，且激活后受精率高、卵裂率高，能夠有效提高周期可用胚胎率。不同的激活試劑的激活原理不同，Ion是一種鏈霉菌屬的抗生素，對Ca2+有高效親和力的離子載體，Ion不是直接引起Ca2+的跨膜轉運而是通過間接降低細胞內的Ca2+濃度來激活卵母細胞[14]。相比Ca2+載體A23187，Ion的化學激活功能特異度更高、效果更好，但它的功能還有待進一步研究。有研究發現高濃度Ion會引起Ca2+振蕩頻率與幅度的上升進而打破線粒體能量代謝平衡，導致活性氧自由基(ROS)升高和腺苷三磷酸(ATP)下降，從而誘發DNA損傷、降低囊胚形成率[15]。現在哺乳動物中廣泛使用的AOA方案中Ion的使用濃度為10 μmol/L，作用時間為10 min。

雖然化學激活劑能夠改善卵裂率和可用胚胎率，但在臨床使用中仍然存在后代安全性如有害、致畸等方面的質疑。Vasilev等[14]運用5 μmol/L(相當于哺乳動物的10 μmol/L)的Ion作用海星卵母細胞10 min后發現，對照組有(88.3±1.4)%卵裂正常，實驗組只有(24.8±10.9)%卵裂正常；實驗組受精卵要么停滯在第1次卵裂期，要么呈現異常卵裂；在隨后的發育過程中對照組(68.3±16.1)%卵裂胚形成正常可用囊胚，而實驗組僅有(16.2±19.3)%卵裂胚形成正常可用囊胚。Heytens等[16]對7～12周B6D2F1小鼠進行控制性促排卵獲得的卵母細胞行Ion化學激活發現，Ion最佳作用濃度亦為10 μmol/L，但是Ion處理組和對照組在囊胚發育、內細胞團和滋養層細胞數目、囊胚著床率和新生胎鼠參數如體長、重量、形態等方面比較均無顯著差異。Norozi-Hafshejani等[17]發現，相比氯化鍶而言Ion有更強的卵母細胞激活功能，但是在胚胎發育上，氯化鍶處理組細胞碎片率顯著低于Ion處理組，這可能跟二者激活原理有關，Ion可以引起Ca2+濃度快速升高，而氯化鍶對Ca2+作用比較溫和，只是引起Ca2+濃度的微量、緩慢上升，但兩組胚胎著床率比較并無顯著差異。國內檀暢等[12]運用氯化鍶激活卵母細胞的研究發現，ICSI聯合氯化鍶輔助激活15枚成熟卵母細胞，雖然僅有4枚胚胎正常受精，但是形成了3枚可用胚胎，融胚移植并成功順產1名健康男嬰，其結果與Norozi-Hafshejani等[17]的研究結果一致。Nasr-Esfahani等[18]研究發現，對因男方是重度畸形精子癥而就診的87對夫婦運用ICSI聯合Ion激活卵母細胞時，行AOA可以有效改善卵裂率并提高可用胚胎率；運用植入前遺傳學診斷(PGD)技術對獲得的胚胎進行遺傳學分析發現，可獲得含正常染色體的胚胎，成功妊娠1年后隨訪子代，體檢并未發現子代有身體及智力障礙等問題。Li等[19]發現ICSI聯合AOA(ICSI-AOA)雖然可以通過提高生育率和可移植胚胎率來彌補ICSI受精失敗，但是不能顯著提高囊胚形成率、妊娠率和移植率。Vanden Meerschaut等[20]發現，在由于精子因素導致ICSI受精失敗的案例中行ICSI-AOA能有效改善囊胚形成率和妊娠結局，而對于非精子因素導致的受精失敗案例則不能影響囊胚形成率和妊娠結局。

本案例中夫婦雙方曾生育1名女孩且有2次流產史，男方精液檢查為少弱精子癥，且女方亦存在宮腔環境問題，所以：(1)無法預先判斷ICSI能否正常受精；(2)直接進行ICSI-AOA也不能保證一定受精；(3)該技術還存在一定的風險，故沒有當天ICSI后即進行AOA技術。ICSI次日觀察受精失敗后進行補救性AOA，受精率顯著提高并獲得可用胚胎，新鮮移植獲得妊娠后成功產下1名健康男嬰。這為我們提供了一個新的思路：ICSI受精失敗后可采取補救性AOA以提高卵母細胞受精率和可利用胚胎率。但從案例中我們也發現由于是在ICSI第2天進行AOA，存在卵母細胞老化且胚胎發育偏慢、優質胚胎率低等問題。所以，如果該對夫婦還有生育要求，下次可于ICSI當日即進行AOA，以保證受精率，提高臨床可用胚胎率。

綜上所述，對于ICSI助孕受精失敗的患者，可以實行補救性AOA方案，以幫助患者獲得可用胚胎。目前臨床上運用化學激活劑進行AOA都是個案報道，缺乏大樣本研究加以證實，且所獲得的胚胎可能存在發育潛能問題。為保障患者權益，在向患者介紹該項技術優越性的同時也要向其詳細說明面臨的風險以及對子代健康可能產生的影響，充分尊重患者的選擇。本研究行ICSI后獲得的可用卵母細胞僅8枚，且沒有設置對照組進行驗證，所以后期一方面要對生產的男嬰健康狀況定期隨訪，另一方面要加大研究力度，收集更多病例數據進行深入分析以探討和評估該技術的安全性，更好地為患者服務。