細菌DNA提取方法的優化

2012-04-29 00:44:03董艷磊

中國高新技術企業 2012年1期

摘要：文章采用大腸桿菌和水稻白葉枯病菌作為實驗菌株，研究了其在不同的超聲時間，不同的破壁方法，不同的酶作用下DNA提取的效果。通過實驗結果比對、優化，得出一種準確、高效的DNA提取方法。

關鍵詞：細菌DNA提取；紫外分光光度計；大腸桿菌；水稻白葉枯病菌

中圖分類號：Q782 文獻標識碼：A 文章編號：1009-2374（2012）01-0041-03

本文選用了大腸桿菌和水稻白葉枯病菌作為實驗菌株，將培養一定時間的菌種所提取的DNA，在紫外分光光度計下進行測定。實驗首先研究超聲時間對大腸桿菌DNA提取效果的影響，其次在傳統法、水煮法、ES法（傳統法+溶菌酶）、ESU法（傳統法+超聲+溶菌酶）之間進行比較，分析不同提取方法提取的兩種菌株DNA的濃度及純度，找出了一種準確、高效的DNA提取方法，為今后生物檢測鑒定工作提供了保障。

一、實驗部分

（一）實驗材料

大腸桿菌：革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×（1～3）μm。周身鞭毛，能運動，無芽胞，是人和許多動物腸道中最主要且數量最多的一種細菌，主要寄生在大腸內。

水稻白葉枯病菌：革蘭氏陰性菌，由水稻黃單胞細菌水稻致病變種侵染引起的嚴重危害水稻生產的一種植物細菌。

（二）實驗方法

1．細菌的培養。根據兩種細菌不同的生長條件制備相應的培養基，具體如下：

水稻白葉枯病菌：（NA培養基）牛肉浸膏3g，蛋白胨7.5g，蔗糖10g，加蒸餾水至1000mL，調至pH7.0，121℃滅菌20min。固體培養基加1.5%瓊脂。

大腸桿菌：（LB培養基）細菌培養用蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，加蒸餾水至1000mL，調至pH 7.0，121℃滅菌20min。固體培養基加1.5%瓊脂。

大腸桿菌培養基放置于37℃的搖床上培養12h，水稻白葉枯病菌培養基放置于28℃的搖床上培養48h，由液體培養基的渾濁度來判斷細菌的生長情況。

2．細菌DNA的提取。

（1）傳統提取法。

步驟一：取3mL過夜培養菌液于離心管中，離心1min，棄上清液，收集菌體；

步驟二：加800μL裂解緩沖液（40mM Tris-醋酸，pH 7.8的20mM 醋酸鈉，1mM EDTA，10% SDS），吹打混勻（槍頭去尖）；

步驟三：加400μL 5M NaCl混勻后，離心12min（時間不能少）；

步驟四：將上清液移至另一離心管中，加入10 μL RnaseA（10mg/mL）37℃溫浴30min；

步驟五：加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25︰24︰1）抽提，充分混勻抽提；

步驟六：離心8 min收集上清，用氯仿抽提一次，離心8 min后吸取上清至新的離心管內；

步驟七：加2倍體積無水乙醇沉淀DNA后離心8 min，用70％乙醇洗滌沉淀2次。

步驟八：干燥后，溶于100 μLTE中于-20℃保存備用。

（2）水煮提取法。取過夜培養的菌液3 mL加入到離心管中離心1 min，棄上清；沉淀加入1.2 mL無菌去離子水，振蕩混勻，100℃水浴10 min后離心5 min，上清即為DNA溶液，-20℃保存備用。

（3）超聲時間對DNA提取效果的影響。在傳統提取法步驟二后使用超聲波（功率400 W）超聲1、3、5和7 min，其他步驟同傳統法。

（4）溶菌酶對細菌DNA提取效果的影響。在傳統提取法步驟一之后加入20μL50 mg/mL的溶菌酶，37℃溫育30 min（不斷振蕩），其他步驟同傳統法。

（5）超聲、溶菌酶雙重效應對DNA提取效果的影響。在傳統提取法步驟一之后加入20 μL 50 mg/mL溶菌酶，37℃溫育30min（不斷振蕩），步驟二之后超聲（功率400W）3 min，其他步驟同傳統法。

3．DNA濃度/純度測定。Agilent 8453紫外分光光度計開機、開燈預熱30min；用重蒸水洗滌比色皿，吸水紙吸干，加入TE緩沖液后，放入樣品室的S池架上，關上蓋板；設定狹縫后校零。將標準樣品和待測樣品適當稀釋（DNA15 μL用TE緩沖液稀釋至3000 μL）后，記錄編號和稀釋度。把裝有標準樣品或待測樣品的比色皿放進樣品室的S架上，關閉蓋板；設定測定的紫外光波長，測定260nm、280nm波長時的OD值及OD260/OD280的比值；計算待測樣品的濃度（μg/μL）=OD260×稀釋倍數×50/1000。

二、結果分析與討論

（一）超聲時間對大腸桿菌DNA提取效果的影響

實驗采用經過12h恒溫搖床培養的大腸桿菌作為實驗菌種，利用傳統提取法、傳統法結合超聲處理1min、3min、5min、7min的方法提取DNA，每種方法所用大腸桿菌菌液量均為3mL，利用紫外分光光度計對提取的DNA測定3次，結果取平均值，實驗結果如圖1、表1所示：

由表1可知，提取的DNA濃度隨著超聲時間的延長而增大，這主要是因為超聲使細菌細胞壁更容易破裂，從而裂解液中SDS能更充分地破壞細胞膜及核膜的結構，使DNA迅速釋放出來。

在超聲過程中發現，以超聲3min破碎細菌提取的DNA OD260/OD280最接近比值1.8，DNA的純度較高，超聲波處理的時間不易過長，最佳破壁時間為3min。

（二）傳統法與水煮法的比較

實驗采用經過12h恒溫搖床培養的大腸桿菌和48 h恒溫搖床培養的水稻白葉枯病菌作為實驗菌種，比較傳統提取法與水煮法提取的DNA濃度與純度。所用菌液量均為3mL，利用紫外分光光度計對提取的DNA測定3次，最后結果取平均值。實驗結果如圖2、表2、表3所示：

由表2、3可知，水煮法得到的DNA濃度比傳統法要高，主要因為水煮法步驟簡潔，減少了操作過程中對DNA的損失及外源DNA污染機會。水煮法提取過程中不需要酚—氯仿抽提及乙醇沉淀，避免了對人體的危害，且所需費用低，但水煮法提取的DNA純度較傳統法有小幅下降，主要是因為抽提過程簡單，DNA溶液中含有蛋白質等雜質無法完全去除。水煮法適用于對DNA純度要求不高的PCR、RAPD等實驗，因高溫使DNA變性，該法不適于限制性內切酶酶切分析。傳統法所需費用低，但操作繁瑣，耗時長，DNA損失量大，產率低，且有污染和毒性作用。

（三）溶菌酶對DNA提取效果的影響

圖3 ES法提取的兩種菌種DNA紫外吸收圖譜

實驗采用經過12 h恒溫搖床培養的大腸桿菌和48 h恒溫搖床培養的水稻白葉枯病菌作為實驗菌種，比較傳統提取法與ES法提取的DNA濃度與純度。菌液量為3mL，用紫外分光光度計對提取的DNA測定3次，結果取平均值，結果如圖3、表4、表5所示：

由表4、表5可知，加入溶菌酶后提取的DNA濃度有明顯的提高，而純度變化不是很大。ES法在提取DNA過程中，使用溶菌酶破壁后的菌液黏稠，不易脫蛋白，DNA黏度大，純度低，DNA被蛋白質纏繞難以舒展變性，對變性過程中相對吸光度增長幅度略有阻礙。

（四）超聲、溶菌酶雙重效應對DNA提取效果的影響

實驗采用經過12 h恒溫搖床培養的大腸桿菌和48 h恒溫搖床培養的水稻白葉枯病菌作為實驗菌種，比較傳統提取法與ESU法提取的DNA濃度與純度，所用菌液量為3 mL，利用紫外分光光度計對提取的DNA測定3次，最后結果取平均值，實驗結果如圖4、表6、表7所示，傳統法、ES法紫外吸收圖譜見圖2、圖3所示：

由表6、表7可知，ESU提取的DNA濃度及純度較傳統法、ES法有很大的提高，效果十分明顯。ESU法在DNA提取過程中，溶菌酶、SDS和超聲波三者聯合作用使細菌破壁更充分，DNA回收量大，純度高，ESU法在超聲前加入溶菌酶，溶菌酶破壁后黏稠的菌液緩沖了單純使用超聲波對DNA造成直接破壞，使提取的DNA片段大小適中，濃度較高。

三、結論

1．DNA濃度及純度可以通過紫外分光光度計檢測出來，速度快，準確度高，影響因素少。

2．DNA濃度隨著超聲時間的延長而增加，而超聲時間為3min的時候檢測出來的DNA純度最好，所以超聲最佳時間為3min。

3．溶菌酶的合理使用能增加提取DNA的濃度。

4．ESU法提取的DNA無論是濃度還是純度都比較理想，是一種值得推廣的提取DNA方法，主要針對于對DNA濃度/純度要求高的實驗。

5．水煮法所需費用低，步驟簡潔，耗時短，減少了DNA損失及外源DNA的污染機會，不需要酚－氯仿抽提及乙醇沉淀，避免了有機溶劑對人體的危害，但提取的DNA濃度一般，純度不高，適用于對DNA純度要求不高的PCR、RAPD等實驗。

四、結語

紫外分光光度法檢測DNA濃度、純度是一種快速、有效的定量方法，可以根據待測物質在紫外區的吸收性質，來精確測定其DNA濃度/純度，為分子生物學的發展及DNA相關的實驗提供了方便。

參考文獻

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