IETM對擬阿爾茨海默病大鼠認知功能及APP、PS1基因表達的影響

趙楠 韓柏 王鋒 韓德五

[摘要] 目的 探討腸源性內毒素血癥（IETM）對擬阿爾茨海默?。ˋD）大鼠認知功能和β淀粉樣前體蛋白（APP）、早老素1（PS1）基因表達的影響。 方法 選用Wistar大鼠，連續注射D-半乳糖和AlCl3 90 d制備擬AD動物模型。運用Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力，鱟試劑法檢測脂多糖（LPS）含量，ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，RT-PCR法檢測APP、PS1基因的表達。 結果 擬AD大鼠逃避潛伏期延長（P ＜ 0.05），LPS、TNF-α水平增加（P ＜ 0.05），且APP、PS1基因表達水平增加（P ＜ 0.05）。 結論 擬AD大鼠模型伴有IETM，其可能是AD發生的危險因素。

[關鍵詞] 阿爾茨海默病；腸源性內毒素血癥；腫瘤壞死因子-α；β淀粉樣前體蛋白；早老素1

[中圖分類號] R749.16[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）16-0004-02

Effect of IETM on neurocognitive function and hippocampal APP, PS1 gene expression in Alzheimers disease rats

ZHAO Nan1 HAN Bai1 WANG Feng2 HAN Dewu2

1.Department of Psychiatry, First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2.Institute of Liver Diseases, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

[Abstract] Objective To investigate the effect of intestinal endotoxemia (IETM) on neurocognitive function and amyloid precursor protein (APP) and presenilin 1(PS1) gene expression in rats with Alzheimers disease (AD). Methods The AD experimental rats injected D-galactose and AlCl3 for 90 days. Subsequently, neurocognitive function of the rats were assessed by Morris water maze; the level of lipopolysaccharide (LPS) was determined by TAL, tumor necrosis factor-α (TNF-α) was determined by ELISA; Hippocampal gene expressions of APP, PS1 were tested by RT-PCR. Results Compared with the normal control group, the experimental group had increased the escape latency (P ＜ 0.05) in Morris water maze test; LPS, TNF-α in AD rats were increased (P ＜ 0.05); the expressions of APP and PS1 mRNA in hippocampus were increased (P ＜ 0.05). Conclusion The rat model of Alzheimers disease is accompanied IETM and that may be a risk factor in the development of AD.

[Key words] Alzheimers disease; Intestinal endotoxemia; Tumor necrosis factor-α; Amyloid beta-protein precursor; Presenilin 1

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一種神經退行性疾病，發病機制尚不明確。多數學者認為AD的發病與β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積所致的慢性炎癥有關，Aβ沉積被認為是AD患者腦部的毒性來源。研究結果顯示，AD是一種自身毒性的改變，炎性反應在其中起重要作用[1]，在AD患者腦內可觀察到明顯的炎性反應和自主免疫反應[2]。腸源性內毒素血癥（IETM）假說[3，4]認為，內毒素激活枯否細胞所分泌的多種活性物質是導致多種病理過程發生凋亡和炎癥反應的重要機制。本研究通過應用D-半乳糖和AlCl3建立擬AD動物模型[5]，觀察大鼠學習記憶能力，并檢測血漿LPS、TNF-α含量以及海馬APP、PS1基因表達水平，從而探討IETM在AD發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物

成年Wistar大鼠60只（雌雄各30只，體重230～300 g），山西醫科大學動物實驗中心提供。

1.2 儀器和試劑

DU640型核酸蛋白分析儀（Beckman公司），UNOII型PCR儀（Biometra公司），鱟試劑盒（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司），TNF-α試劑盒（北京東亞免疫技術研究所）等。

1.3 制備擬AD動物模型

60只Wistar大鼠隨機分為對照組和模型組，模型組連續注射D-半乳糖[60 mg/（kg·d），生理鹽水配制]和AlCl3[5 mg/（kg·d），雙蒸水配制]90 d；對照組注射等量生理鹽水和雙蒸水。

1.4 Morris水迷宮實驗

采用Morris水迷宮法測試大鼠認知功能[6]，記錄大鼠游到終點的時間（逃避潛伏期）。

1.5 LPS、TNF-α測定

腹主動脈取血，嚴格按試劑盒說明檢測。

1.6 APP和PS1基因表達的檢測

提取大鼠海馬mRNA，應用RT-PCR技術檢測APP和PS1基因的表達。

1.7 統計學處理

用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，數據以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮實驗

兩組大鼠潛伏期隨著訓練次數增加而縮短。經過重復測量方差分析可認為5個時間點間5個時間段的潛伏期存在二次曲線的變化趨勢（F = 6.937，P ＜ 0.01）；兩組間比較差異有統計學意義（F = 4.937，P ＜ 0.05）。見表1。

表1 兩組大鼠逃避潛伏期的比較（x±s）

注：與對照組相比，*P ＜ 0.05

2.2 LPS、TNF-α的變化

模型組LPS、TNF-α及腦細胞凋亡水平較對照組均明顯升高（t = 3.21、2.95、4.67，P ＜ 0.05），說明在模型組大鼠體內發生了內毒素血癥。見表2。

表2 兩組大鼠血漿LPS、TNF-α含量及凋亡率（x±s）

注：與對照組相比，*P ＜ 0.05

2.3 海馬內APP和PS1基因表達的比較

表3和圖1、2可看出模型組APP、PS1表達水平較對照組高（P ＜ 0.05）。

表3 兩組大鼠APP、PS1基因的表達（x±s，%）

注：與對照組相比，*P ＜ 0.05

3 討論

AD是由多種因素共同作用形成的?；罨男∧z質細胞（MG）是AD的又一病理特征，MG的激活是神經元死亡的早期事件[7]。近年來研究表明，Aβ聚集能活化MG和星形膠質細胞，引起炎癥反應和神經毒性作用，是AD發病的核心機制[8]。MG、肝臟枯否細胞和血液中單核細胞均屬單核巨噬細胞系統，內毒素作為最敏感的激活劑[9]，可激活免疫細胞觸發炎癥因子級聯反應。當內毒素激活大量MG，可釋放多種細胞因子、補體及其激活物等[10]，從而誘發炎癥反應、自由基聚集、鈣離子平衡紊亂，導致細胞凋亡，可能是AD發生的重要機制。LPS作為IETM的核心成分，可直接損傷細胞，并激活枯否細胞和單核細胞，釋放更多的促炎介質（TNF-α、IL-1等）介導組織損害。TNF-α可大量存在于老年斑周圍，還可上調環加氧酶2，增加有害自由基的產生[11]，進一步加重炎癥反應。

本研究揭示D-半乳糖和AlCl3建立的擬AD大鼠模型可在基因水平調控APP和PS1基因，使其表達增高。研究結果表明，模型組大鼠體內LPS水平高于對照組（t = 3.21，P ＜ 0.05），說明在模型組大鼠體內發生了IETM；我們還觀察到模型組認知功能明顯下降（F = 6.937，P ＜ 0.01），且APP和PS1基因表達水平增加，提示IETM可使AD大鼠認知功能下降，可能與APP和PS1基因表達上調有關；模型組大鼠體內TNF-α水平高于對照組（t = 2.95，P ＜ 0.05），提示高水平TNF-α發揮了神經毒性作用，與AD的發病有關。

綜上所述，在體內增高的LPS刺激下，TNF-α水平升高，與此同時，LPS可誘導模型大鼠腦內APP和PS1 mRNA的表達，從而促進腦組織Aβ沉積。本實驗結果表明，擬AD大鼠模型有IETM的發生，可致大鼠認知功能下降以及血漿LPS、TNF-α含量和海馬APP、PS1基因表達水平的增加。由此可見，IETM可能是AD發生過程中一個重要的危險因子，通過本研究能夠為明確AD的發病機制提供新的思路和理論依據。

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（收稿日期：2012-03-16）