骨碎補水提液對大鼠成骨細胞OPG mRNA表達的影響

趙曉燕，劉鐘杰，李彩虹，李 琴，邢曉旭，田 丹，韓 博

（中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193）

骨碎補味苦、性溫，入肝、腎經。始載于《本草拾遺》，主治腎虛腰痛，骨傷，風濕痹痛。是補腎中藥中的佼佼者，與其他中藥同等條件下作用于成骨細胞株，作用最為突出［1］。骨碎補多項臨床及動物試驗表明，其檢驗指標與骨保護素（OPG）互為聯系［2］。本試驗以大鼠成骨細胞為模型，假定骨碎補水提液能調節OPG mRNA的表達，且作用與雌激素受體通路相關。

1 材料與方法

1.1 藥液制備 骨碎補飲片，購自北京同仁堂，將其和蒸餾水按1∶10（W∶V）的比例混合，文火加熱沸騰25min，濾出藥液后再加8倍蒸餾水煮沸25 min，合并兩次濾液離心取上清液，旋轉蒸發濃縮成濃度為2g／mL的生藥液，調pH 值至7.2～7.4。臨用前用DMEM完全培養液配制成不同濃度的骨碎補培養液，以不加藥物的DMEM完全培養液作為對照組。

1.2 細胞培養、鑒定 新生24h內SD大鼠，購自北京興隆實驗動物場，參照吳培福方法，體外培養大鼠顱骨成骨細胞［3］。并通過形態學觀察、瑞氏染色和鈣化結節染色的方法對所培養的細胞進行鑒定，鑒定成骨細胞培養成功。

采用第3代細胞進行試驗。細胞同步化后，試驗組換為含不同濃度骨碎補水提液、陽性對照組換為含雌二醇完全培養液；陰性對照組換為完全培養液，或者試驗組換含10mg／mL骨碎補水提液＋10－7mol／L ICI 182 780的完全培養液，作用48h后提取總mRNA。

1.3 細胞總 mRNA的提取 按照說明書，用Trizol法提取細胞總RNA。

1.4 RT－PCR 按照試劑盒說明書進行反轉錄，cDNA為模板進行基因擴增，引物序列見表1，產物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

表1 大鼠成骨細胞中β－actin、OPG引物序列

1.5 目的基因的克隆制備 按照說明書對PCR產物進行純化、回收。回收產物與pEASY－T3載體連接后，轉化到感受態細胞中，挑取陽性克隆，37℃ 搖床過夜培養后菌液送檢測序，用質粒提取試劑盒提取陽性菌液質粒。

1.6 β－actin、OPG標準曲線構建和不同組成骨細胞中基因水平的檢測 構建這2個基因的標準曲線，以不同處理的成骨細胞cDNA作為模板，用熒光定量PCR對基因進行檢測，通過標準曲線計算得出OPG的表達水平。

1.7 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行單因素方差分析，P＜0.05顯著性差異，P＜0.01極顯著性差異。所有數據均以平均數±標準差表示。

2 結果

不同濃度骨碎補水提液作用于成骨細胞48h后，10mg／mL組、1mg／mL組、0.1mg／mL組顯著促進OPG基因水平的表達，其中10mg／mL組作用與雌二醇組差異不顯著；0.01mg／mL、0.001 mg／mL促進作用不顯著，見圖1。

10mg／mL骨碎補水提液與雌激素受體抑制劑一同作用于成骨細胞后，促進OPG基因水平表達的作用受到抑制，見圖2。

3 討論

骨骼是代謝活躍的器官，在整個生命過程中都在進行著吸收與重建。這個過程受成骨細胞的調控：成骨細胞表達NF－κB受體活化因子配體（RANKL）與破骨細胞前體細胞表面上的NF－κB受體活化因子（RANK）結合，促進破骨細胞的分化及骨吸收；同時成骨細胞還分泌OPG，與RANKL競爭性結合，從而抑制RANKL和RANK之間的作用，以防止骨吸收過度。因此OPG、RANKL任何一方的改變都能影響骨吸收或重建的進程。

廖悅華等通過動物試驗證明，骨碎補能抑制激素缺乏引起的骨流失，對糖皮質激素引起的骨質疏松也有一定作用［4－6］。大量細胞試驗證明，骨碎補提取物及其主要成分對成骨細胞或骨髓基質細胞的增殖、分化及鈣化均有促進作用［7－9］。有試驗證明，骨碎補提取物抑制破骨細胞性骨吸收［10］。種種跡象表明，骨碎補是治療骨質疏松的有效藥物。有試驗證明，以骨碎補主要成分的骨靈片能顯著提高去勢小鼠血清中OPG／RANKL比值［11］。本試驗中，一定濃度的骨碎補作用于成骨細胞，高劑量組顯著促進OPG基因水平的表達，低劑量組促進作用不顯著。證明骨碎補水提液能增高大鼠成骨細胞內基因水平OPG的表達，且呈劑量依賴關系。推測，骨碎補主要通過作用于OPG影響OPG／RANKL／RANK系統，進而影響破骨細胞的增殖分化。

本試驗中，雌激素受體抑制劑與骨碎補共同作用于成骨細胞后，骨碎補促進OPG表達作用受到抑制，與骨碎補單獨培養差異顯著。因此，雌激素受體通路至少是骨碎補促進OPG基因表達，增高OPG／RANKL比值的通路之一。周繼凱試驗證明，骨碎補促進小鼠成骨細胞增殖、分化是通過雌激素受體通路［12］。骨碎補通過雌激素通路對成骨細胞起作用，由此可以推測其為潛在的植物性雌激素。對骨碎補詳細的機制研究有助于其在臨床上的應用。

［1］Chang E J，Lee W J，Cho S H，et al.Proliferative effects of flavan－3－ols and propelargonidins from rhizomes of Drynaria fortunei on MCF－7and osteoblastic cells［J］.Arch Pharm Res，2003，26（8）：620－630.

［2］劉鐘，郭梁，吳亞東，等.骨碎補總黃酮作用于 OPG／RANKL／RANK軸系統的相關研究［J］.中華中醫藥學刊，2010（2）：271－274.

［3］吳培福，鐘代彬，曲偉杰，等.小鼠成骨細胞改良酶的消化分離培養［J］.甘肅農業大學學報，2004（5）：512－515.

［4］廖悅華，梁瓊，王卓，等.中藥骨碎補對去睪丸骨質疏松癥動物模型的影響［J］.中國骨質疏松雜志，2007，13（4）：277－280.

［5］賈紅蔚，王寶利，鄺晨鐘，等.骨碎補與雌激素對去卵巢大鼠骨質疏松作用的對照研究［J］.中國中西醫結合雜志，2006（S1）：116－119.

［6］馬克昌，高子范，張靈菊，等.骨碎補對大白鼠骨質疏松模型的影響［J］.中醫正骨，1992（4）：3－4.

［7］鄧展生，張璇，鄒冬青，等.骨碎補各種提取成分對人骨髓間充質干細胞的影響［J］.中國現代醫學雜志，2005，15（16）：4.

［8］唐琪，陳莉麗，嚴杰.骨碎補提取物促小鼠成骨細胞株MC3T3－E1細胞增殖、分化和鈣化作用的研究［J］.中國中藥雜志，2004，29（2）：5.

［9］徐展望，張建新，李軍，等.骨碎補提取液對兔骨髓基質細胞增殖的影響［J］.中醫正骨，2005，17（4）：3.

［10］樊粵光，黃永明，曾意榮，等.骨碎補提取液對體外分離破骨細胞性骨吸收的作用［J］.中國中醫骨傷科雜志，2003（6）：6－8.

［11］曹艷艷，李娟，楊春莉，等.骨靈片對骨質疏松大鼠血清opg／Rankl、Picp和相關細胞因子的影響［J］.熱帶醫學雜志，2007，7（7）：4.

［12］周繼凱，李煥德.2－骨碎補促成骨細胞分化作用的機制研究：湖南省藥學會第12次會員代表大會暨2008年學術年會［C］.長沙：2008.