點陣CO₂激光作用小鼠皮膚光老化模型后創面愈合過程中皮膚超微結構的變化

丁衛　譚軍　李高峰　歐陽華偉　秦曉東

[摘要]目的：觀察點陣CO2激光作用小鼠皮膚光老化模型后創面愈合過程表皮的超微結構的變化規律。方法：將5只昆明小鼠以UVB紫外線照射，制備成皮膚光老化模型，行點陣CO2激光（Deep FX）干預，觀察激光創面愈合情況，并且分別于干預前、干預后第1、3、7、15天取材，進行HE染色和電鏡觀察。結果：點陣CO2激光作用于小鼠皮膚光老化模型后，術后第1天，見激光損傷灶周圍變性組織及細胞水腫，成纖維細胞線粒體體積增大；術后第3天見表皮細胞向創底遷移，成纖維細胞出現增生，細胞內線粒體增多，粗面內質網擴張，膠原纖維見周期性橫紋；術后第7天激光損傷灶創底見表皮細胞增殖，創面基本愈合，成纖維細胞增生活躍，線粒體、粗面內質網豐富，內質網擴張明顯、膠原纖維增多增粗；術后第15天，成纖維細胞趨于穩定，膠原纖維排列密集。結論：點陣CO2激光通過對表皮的線粒體、粗面內質網產生影響，達到對光老化皮膚良好療效。

[關鍵詞]光老化；點陣CO2激光；超微結構

[中圖分類號]R730.57[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）10-0-0

光老化是人體暴露部位皮膚衰老的主要原因，隨著生活水平的提高，皮膚衰老的防治已經成為人們生活的重要部分。目前點陣CO2激光治療皮膚光老化具有良好的療效，在臨床上得到廣泛的應用，點陣CO2激光作用于光老化皮膚后，皮膚修復過程中其超微結構發生的病理變化以及這些變化的意義值得研究。本研究采用UVB照射小鼠背部皮膚，制造皮膚光老化模型，點陣CO2激光干預后，取材連續電鏡觀察創面愈合過程中皮膚超微結構的變化規律，現報道如下。

1材料和方法

1.1 主要儀器： LKB-Ⅲ型超薄切片機（瑞士）H-7500型透視電鏡（日本）。

1.2 動物模型制備及實驗分組

1.2.1 動物：清潔級昆明種小白鼠5只，體重20～25g，雌雄不限。

1.2.2 小鼠皮膚光老化模型制備：剪除小鼠背部5cm×10cm區域的毛，用15W＼UVB紫外燈置于小鼠背部裸露皮膚區正上方35cm處，每天照射2h，共照射50天，每天用電動剃須刀剔除生長出的小鼠毛，觀察小鼠皮膚變化，并拍照。

1.2.3 點陣激光干預：選用C02點陣激光（Deep FX，LUMENIS Ltd，美國），能量25～30 mJ，密度15%，單次掃描。創面予四環素眼膏外涂，一天3次。

1.3 觀察指標

1.3.1 大體觀察：每組小鼠取材時觀察激光干預后皮膚創面愈合情況。創面愈合以創面封閉且完全上皮化為判定標準。

1.3.2 組織學觀察：分別于干預前、干預后第1、3、7、15天取材，切取1cm×0.5cm皮膚組織標本。組織標本固定后，包埋，切片，行組織學觀察。 HE染色：觀察切片炎性細胞數量、膠原纖維排列、創面愈合變化情況。電鏡觀察： 表皮成纖維細胞內超微結構及膠原纖維的變化規律。

2結果

2.1 小鼠皮膚光老化模型的鑒定：小鼠背部皮膚照射區出現皺紋、變厚變硬、色素沉著等改變。HE染色表皮厚度不均，角質層增厚，表皮真皮連接境界清楚，膠原纖維排列紊亂。證明皮膚光老化動物模型制備成功（圖1）。

2.2 大體觀察：治療過程中可見明顯的皮膚收縮，治療完后以四環素眼膏外涂，每日3次。術后第1天，小鼠背部創面稍有紅腫，無明顯滲出。術后第2天，可見部分創面結痂。術后第3天，創面結痂，紅腫基本消退，無滲出。術后第4天，創面痂皮出現脫落。術后第7天，創面痂皮基本脫落，可見少量毛發生長。術后第15天，創面完全愈合，毛發生長較快，皮膚色素及紋理較前減輕，創面無滲出等感染征象。

2.3 HE 染色：術后第1天，可見激光損傷灶周圍變性組織及周圍細胞水腫，真皮膠原纖維水腫（圖2）。術后第3天，可見炎性細胞浸潤，真皮膠原纖維水腫表皮細胞向創底遷移（圖3）。術后第7天，激光損傷灶位置真皮層大量的炎性細胞浸潤，變性膠原纖維處可見增生膠原纖維，損傷灶基底見表皮細胞增殖，損傷灶處表皮細胞呈多層分布（圖4）。術后15天，真皮膠原纖維排列有序，緊密，表皮組織結構恢復，毛囊有增生（圖5）。

2.3 電鏡觀察：電鏡下觀察皮膚成纖維細胞超微結構及膠原纖維的變化， 結果顯示：光老化皮膚成纖維細胞線粒體腫脹膜性結構模糊，內質網擴張明顯；膠原纖維分布不均勻，排列紊亂，周期性橫紋消失；橫斷面可見膠原纖維直徑大小不均（圖6）。激光治療術后第1天可見成纖維細胞線粒體體積增大，膠原纖維橫紋不清楚，變性膠原纖維呈高電子密度團塊，間隙增大（圖7）；術后3天，成纖維細胞出現增生，線粒體體積增大，數量增多，膠原纖維見周期性橫紋（圖8）；術后第7天成纖維細胞增生活躍（圖9），線粒體、粗面內質網豐富（圖10、11），內質網擴張明顯；膠原纖維增多增粗；術后第15天，成纖維細胞趨于正常，線粒體、粗面內質網較前減少，膠原纖維排列密集新生的膠原纖維分布豐富，周期性橫紋清晰（圖12）。

3討論

光老化皮膚的主要組織學特征是皮膚基質構成的改變，即膠原蛋白成分的減少和異常彈性纖維蛋白沉積[1]。成纖維細胞是皮膚中最主要的細胞類型，細胞內的線粒體能為細胞的生命活動提供場所，是細胞內氧化磷酸化和形成ATP的主要場所；粗面內質網合成分泌蛋白質，，成纖維細胞各種生物學特性的改變是皮膚光老化形成的最重要基礎[2]。

紫外線照射皮膚可產生活性氧，降低皮膚成纖維細胞的活性及增殖能力，損傷線粒體[3]，膠原與彈性蛋白降解[4]，從而導致皮膚過早出現粗燥、皮溝加深、毛細血管擴張、色斑等損害性癥狀，嚴重影響了人們的外表。隨著生活水平和審美標準的提高，人們對皮膚光老化的防治越來越重視。

在過去的20年中，超脈沖CO2激光換膚術被認為是治療面部皮膚光老化的“金標準”[5]，2004年，Manstein等引入了激光嫩膚的新概念--點陣式光熱分解作用[6]。點陣CO2激光其獨特的作用形式--陣列樣排列的微小光束作用于皮膚，形成柱形結構的微小熱損傷區，極大的減少了術后副作用的發生，被廣泛的應用于臨床治療面部光老化[7-8]，但目前其對皮膚超微結構的影響尚無相關報道。

筆者采用點陣CO2激光作用于小鼠光老化皮膚模型，觀察激光術后創面愈合過程中皮膚成纖維細胞的超微結構及膠原纖維的變化規律。結果表明，小鼠的光老化皮膚表現為成纖維細胞內線粒體腫脹、粗面內質網擴張，膠原纖維膠分布不均勻，排列紊亂，周期性橫紋消失，橫斷面可見膠原纖維直徑大小不均；術后第1天成纖維細胞稀少，細胞內線粒體體積增大，粗面內質網擴張，膠原纖維橫紋不清楚，膠原纖維灶性鈣化壞死。術后第3天成纖維細胞出現增生，線粒體體積增大、數量增多，膠原纖維見周期性橫紋；術后第7天成纖維細胞數量明顯增多，胞體增大，具有三角形、梭行等多形性，胞質內充滿擴張的大量粗面內質網，線粒體豐富，膠原纖維增粗增多；后第15天成纖維細胞形態基本正常，核仁明顯，膠原纖維排列緊密，新生的膠原纖維分布豐富，周期性橫紋清晰。在點陣CO2激光作用于光老化皮膚后創面的修復過程中，筆者先觀察到成纖維細胞的線粒體出現體積增大，以后出現線粒體、粗面內質網數量增多，粗面內質網明顯擴張，成纖維細胞增生，新生的膠原纖維，可以認為首先線粒體的功能增強，產生ATP的增多，為粗面內質網合成功能的增強，細胞的增殖提供動力支持，而后粗面內質網明顯擴張，數量增多，合成與分泌蛋白能力的增強，為膠原纖維的新生，細胞的增殖提供物質支持。在點陣CO2激光作用皮膚光老化后創面的修復過程中，成纖維細胞內的線粒體及粗面內質網等超微結構的改變發揮著重要的作用。

Pires Oliveira 等[9]用半導體激光的照射成骨細胞，發現照射后的24h、48h后核周區域出現了密集的線粒體。增殖72h后，線粒體形態呈絲狀到顆粒狀改變，線粒體分布于整個細胞漿內，認為低能量激光可以改變線粒體活性，促進細胞的增殖。Paulo等[10]通過觀察低能量激光照射皮膚傷口愈合情況，發現低能量激光促進傷口的愈合，增強了線粒體呼吸鏈膜蛋白復合體Ⅱ（琥珀酸-Q還原酶）和Ⅳ（細胞色素氧化酶）的活性。筆者認為在本研究中點陣CO2激光作用于光老化皮膚后，線粒體呼吸鏈膜蛋白復合體Ⅱ（琥珀酸-Q還原酶）和Ⅳ（細胞色素氧化酶）的活性增強，線粒體內膜的跨膜電位梯度和pH梯度的增加，致使質子動力勢（即電化學梯度）增加，線粒體氧化還原狀態改變，加速了跨膜物質轉運，從而加快的電子傳遞反應，增加了ATP合成。線粒體氧化還原狀態及能量代謝的改變，引起一系列細胞效應，促進創面的修復。

點陣CO2激光治療皮膚光老化后皮膚自我修復過程中，引起成纖維細胞中超微結構變化的分子調控機制，仍需要筆者的進一步研究。

[參考文獻]

[1]Kang S，Fisher GJ，Voorhees JJ，et al.Photoaging and topical tretinoin[J].Arch Dermatol 1997，133：1280-1284.

[2]Fisher GJ，Wang ZQ，Datta SC，et al.Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light[J].N Engl J Med，1997，337（20）：1419-1428.

[3]王玉貞，郭沈波，等.長波紫外線對人真皮成纖維細胞線粒體損傷的研究[J].青島大學醫學院學，2002，38（3）245-246.

[4]嚴淑賢，徐昱，胡躍，等.氮氧化物對中波紫外線照射下包皮成纖維細胞的保護作用[J].中華老年醫學雜志，2005，24（10）：753-756.

[5]Fitzpatrick RE， Goldman MP，et al.Pulsed carbon dioxide laser resurfacing of photoaged facial skin.Arch Dermatol，1996，132（4）：395-402.

[6]Manstein D， Herron GC， et al. Fractional phothermolysis： A new concept for cutancous remodeling using microscopic patterns of thermal injury[J].Lasers Surg Med，2004，34（5）：426-438.

[7]鄒彥芬，葉庭路，鐘綺麗，等.雙波長復合點陣激光治療皮膚光老化的療效觀察[J].中國美容醫學，2012，21（3）：501-502.

[8]陳啟文，路水紅，等. CO2點陣激光治療皮膚光老化的臨床隨機對照試驗[J].中國美容醫學，2011，20（3）：34-35.

[9]Pires Oliveira DA，de Oliveira RF，Zangaro RA，et al. Evaluation of low-level laser therapy of osteoblastic cells[J].Photomed Laser Surg，2008，26（4）：401-404.

[10]PCL.Silveira， Emilio L.Streck ， Ricardo A.Pinho，et al. Evaluation of mitochondrial respiratory chain activity in wound healing by low-level laser therapy[J].J Photoch Photobio B，2007，86（3）：279-282.

[收稿日期]2012-06-29[修回日期]2012-08-14

編輯/張惠娟