外周血HBV cccDNA檢測的臨床應用

許鍇 張德亭 鄭加永 柳牡丹

[摘要] 目的 通過對乙型肝炎患者外周血單個核細胞及血漿中共價閉合環狀DNA（cccDNA）的檢測，初步探討其外周血檢測對乙型肝炎診治的價值。 方法 將86例確診為乙型肝炎患者根據病情分為3組，急性乙型肝炎(AHB)、慢性乙型肝炎(CHB)及HBsAg無癥狀攜帶者(ASC)組。采集外周血，分別檢測ALT、AST、總膽紅素（TBIL）、cccDNA、HBV-DNA。 結果 三組血漿cccDNA檢測 結果有顯著性差異（P＜0.01）。單個核細胞cccDNA 7個標本陽性，血漿cccDNA與HBV-DNA、ALT 、AST 、TBIL相關系數分別為0.817、0.402、0.450、0.221。 結論 血漿cccDNA在乙型肝炎患者的各個病程有顯著性差異，單個核細胞cccDNA儲存池確實存在但濃度較低難以檢測。血漿cccDNA與HBV-DNA、ALT、AST相關，但與TBIL無明顯相關。

[關鍵詞] 乙型肝炎；HBV-DNA；共價閉合環狀DNA

[中圖分類號] R512.6+2[文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）02-0064-03

Clinical apply of peripheral blood HBV cccDNA detection

XU Kai1 ZHANG Deting1 ZHENG Jiayong1 LIU Mudan2

1.Wenzhou Third People's Hospital in Zhejiang Province， Wenzhou 325000, China； 2.Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, China

[Abstract] ObjectiveTodetectboth peripheral blood mononuclear and plasmacovalently closed circular DNA(cccDNA) of HBV patients, to investigate peripheral blood cccDNA value for HBVdiagnosis and treatment. MethodsDivided86 cases ofHBV patients into three groups, acute hepatitis B (AHB), chronic hepatitis B (CHB), HBsAg asymptomatic carriers (ASC) group. Peripheral blood was collected, we detectedALT, AST, TBIL, cccDNAand HBV-DNA, then analyzed the result with SPSS 11.0. Results With rank sum test, there were significant difference for cccDNA among three groups (P＜0.01). Seven samples was positive for peripheral blood mononuclear, plasma HBV-DNA and cccDNA, ALT, AST, TBIL correlation coefficients were 0.817, 0.402, 0.450, 0.221. The cccDNA in the plasma of all patients with hepatitis B disease were significantly different, mononuclear cells cccDNA storage pool does exist but it's low and difficult to detect. Conclusion Concentration ofplasma cccDNA is related with HBV-DNA, ALT, AST, but no significant correlation with TBIL.

[Key words] Hepatitis B； HBV-DNA；Covalently closed circular DNA

目前臨床主要依靠血清學方法檢測HBsAg來診斷乙型肝炎感染情況，同時通過HBV-DNA的檢測反映病毒復制情況或水平，用于患者病情的監測以及抗病毒療效。2008年，吳月平[1]等報道了乙型肝炎病毒感染的肝細胞核內可檢測到一種不同形式的病毒DNA-共價閉合環狀DNA(cccDNA)，它不與蛋白共價結合，是乙肝病毒基因組的復制中間體，是rcDNA(松弛環狀DNA)基礎上合成的產物，又是前基因組mRNA合成的模板，它是評價HBV感染狀態及藥物療效最重要的指標。目前cccDNA的檢測多停留于科研階段并未大規模應用于臨床，且目前研究肝細胞中cccDNA的報道多見，但外周血特別是單個核細胞(PBMC)的報道較少見。有文獻報道,乙型肝炎患者PBMC中存在乙型肝炎DNA及病毒復制中間產物RNA[2] ，但對于PBMC中是否含有cccDNA、是否有復制都存在爭議，且臨床意義并不明確[3,4]。本文就86例乙型肝炎患者進行外周血單個核細胞和血漿中cccDNA的檢測，探討外周血HBV cccDNA檢測的臨床應用價值，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

選取2009年1～9月本院住院的乙型肝炎患者86例，男46例，女40例；年齡16～77歲,平均（43.9±17.0）歲，其中慢性乙型肝炎（CHB）36例、急性乙型肝炎（AHB）20例、HBsAg無癥狀攜帶者（ASC）30例，診斷符合2000年病毒性肝炎防治方案Ⅲ及2005年《慢性乙型肝炎防治指南》[5]。

1.2 標本來源

用真空管采集上述乙型肝炎患者靜脈血5mL，2mL血液用EDTA-K2抗凝，3mL血液不用抗凝。不抗凝血分離血清，用于ALT 、AST 、TBIL檢測；抗凝血離心分離血漿，用于血漿cccDNA與HBV-DNA檢測；離心后的血細胞層加淋巴細胞分離液，提取單核細胞進行cccDNA檢測。

1.3 實驗方法

ALT、AST和TBIL在OLYMPUS 5400全自動生化分析儀上測定；HBV-DNA的實時熒光定量檢測試劑購自上海科華生物有限公司；血漿cccDNA和單核細胞cccDNA的實時熒光定量檢測試劑購自上海申友生物技術有限公司，在ABI 7500熒光定量PCR擴增儀檢測。HBV-DNA的抽提使用經典的酚氯仿抽提法[6]。

1.4 統計學處理

使用SPSS軟件，對三組結果的比較使用秩和檢驗，對于不同指標之間的數據使用秩相關分析。

2 結果

2．1急性乙型肝炎

急性乙型肝炎20例血漿cccDNA陽性18例，陽性率90%；慢性乙型肝炎36例，cccDNA陽性18例，陽性率50%；HBsAg無癥狀攜帶者組30例，沒有cccDNA陽性病例，陽性率0。三組之間采用秩和檢驗，有顯著性差異（P＜0.01）；cccDNA陽性的病例其濃度分布有明顯分別；急性乙型肝炎組濃度明顯高于慢性乙型肝炎（P＜0.01）。

2．2 單個核細胞cccDNA的檢測

單個核細胞cccDNA的檢測只有急性乙型肝炎組有7例陽性，且濃度明顯低于外周血的含量。

2．3 血漿cccDNA與HBV-DNA、ALT、AST、TBIL秩相關

血漿cccDNA與HBV-DNA、ALT、AST、TBIL秩相關系數分別為0.817、0.402、0.450、0.221；乙型肝炎患者血漿中cccDNA水平與HBV-DNA的秩相關系數 Rs=0.817, P＜0.01，可以認為乙型肝炎患者血漿中cccDNA與HBV-DNA水平存在正相關。乙型肝炎患者血漿中cccDNA水平與AST的秩相關系數Rs=0.450, P＜0.01，可以認為乙型肝炎患者血漿中cccDNA水平與AST存在正相關。乙型肝炎患者血漿中cccDNA水平與ALT的秩相關系數Rs=0.402, P＜0.01,可以認為乙型肝炎患者血漿中cccDNA水平與ALT存在正相關。乙型肝炎患者血漿中cccDNA水平與TBIL的秩相關系數Rs=0.221, Rs＜0.4，根據相關系數重測信度評價，R應達到0.4以上，可認為cccDNA水平與TBIL相關性無意義。

3 討論

乙型肝炎病毒的復制是一種保守的機制，在轉錄后模板仍然完整。乙肝DNA的復制，cccDNA是前基因組mRNA合成的模板，轉錄前基因組RNA，逆轉錄產生負鏈DNA，再合成雙鏈DNA，繼而成熟為cccDNA，是一個連續的過程[7]。cccDNA的產生過程相當復雜，目前尚未對cccDNA的形成有明確的結論，但cccDNA作為乙肝DNA的復制模板是感染病程的關鍵因素，所以乙型肝炎治療的關鍵因素是清除和抑制cccDNA。cccDNA的檢測特別是外周血cccDNA在臨床上具有重要作用，但相關資料不多。由于肝組織標本取材限制，直接cccDNA維持和清除機制進行研究受到嚴重阻礙，到目前為止體內cccDNA的濃度、運轉和清除機制都還知之甚少。我們可以進行假設，轉氨酶等酶類存在于肝細胞胞質和線粒體中，這些物質在肝細胞損傷時可以直接釋放入血，同理細胞核內的ccDNA分子在肝細胞損傷時也應該可以釋放到血液中，而且這種釋放會隨著肝損程度的增加而增加。對于同一個患者而言，在不同時間段內，其cccDNA水平應該也相應發生變化，對判斷病情有意義。目前通過肝活檢來監測乙肝患者肝組織中的cccDNA水平變化存在著一定困難，因而監測外周血中的cccDNA動態變化更具有現實意義。

本課題對86例乙型肝炎患者進行分組，使用實時熒光定量PCR法檢測患者血漿中cccDNA。急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、HBsAg無癥狀攜帶者三組之間cccDNA分布位置有差異；86例患者血漿cccDNA水平與ALT、AST存在正相關，而這兩個指標可以代表肝功能損害。但患者血漿中cccDNA與血漿中TBIL并無相關性，可能因為TBIL升高是反應重度肝損的指標，當有大量肝細胞損傷壞死時TBIL才會升高，當肝細胞炎癥和輕度損傷時其升高并不明顯。因此，血漿檢測出的cccDNA可以作為肝臟損害的標志，可以反映乙肝患者病情進展及程度，同時也反映了實時熒光定量PCR法檢測乙型肝炎患者血漿中HBV cccDNA靈敏度較高、特異性強，可以應用于臨床來監測乙肝患者血漿中cccDNA的水平及動態變化。

PBMC是體內免疫活性細胞的集合體，這些細胞在機體免疫應答中發揮重要作用。有研究表明[8]，HBV肝外的一個重要靶細胞就是PBMC，PBMC在乙肝免疫功能及病毒持續改變發揮特定的作用，在患者PBMC中檢測出cccDNA，說明HBV可以感染PBMC。本文研究發現在乙型肝炎患者PBMC中cccDNA有7例陽性，占8.3%,說明HBV不但可以感染PBMC，而且可以在其中復制。但本實驗PBMC中cccDNA檢出率較低，且濃度均較低，與鄭守虎[9]等報道的60%的陽性比率相差很大，可能為我們實驗分組方式稀釋了陽性比率，且我們本次實驗采用ATP酶降解標本中的松弛環狀DNA（rcDNA）,大大減少了HBV-DNA對cccDNA檢測造成的影響。本實驗驗證了cccDNA復制的肝外儲存池的存在，可以解釋血漿cccDNA水平與ALT、AST相關系數較低的原因：肝細胞不是外周血cccDNA的唯一來源，PBMC也是外周血中cccDNA的另一來源。PBMC中cccDNA的檢測可以在乙型肝炎患者抗病毒治療的療效判斷中發揮重要作用，抗病毒藥物能否殺滅PBMC中的cccDNA也是觀察乙肝復發的重要指標。

本實驗存在的問題是: 實驗樣本量較小； cccDNA敏感度低于HBV-DNA；乙型肝炎患者的ALT、AST易受降轉氨酶藥物治療等原因的影響等。有待進一步增加樣本數量及動態觀察慢性乙型肝炎患者發病各期的cccDNA水平，以確定其水平與乙肝患者病情輕重、病情進展的關系。

[參考文獻]

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[9]鄭守虎，董慶鳴. 套式聚合酶鏈反應法檢測外周血單個核細胞中HBV cccDNA[J]. 中國衛生檢驗雜志,2008，18（11）：2317-2318.

（收稿日期：2011-01-11）