Hsp90α促進慢性難愈性創面愈合作用研究進展

王芳 栗勇 　蘇映軍

慢性難愈性創面，簡稱慢性創面，系指臨床治療4～6周以上的難愈合或不愈合創面。多由靜脈曲張、糖尿病、動脈炎、動脈硬化、神經系統疾病及腫瘤等引起。據統計，全世界約有1%的人口被持續性的創面問題所困擾，約5%的醫療費用花費在創面修復上。在美國，每年在慢性糖尿病創面愈合治療方面的費用已超過250億美元[1]。而我國，據統計僅糖尿病所致慢性創面患者就達4 000萬例。隨著人口老齡化和糖尿病、下肢靜脈潰瘍等發病率的不斷上升，難愈性創面的發生率也越來越高[2]；由于缺乏有效的治療，這將發展為嚴重的社會問題，因此探索創面愈合機制及尋找一種高效經濟的治療方法顯得十分迫切。

正常創面愈合過程可大致分為三個階段：局部炎癥反應階段、細胞增殖分化階段和組織塑形重建階段。創面愈合的病理生理機制是一個動態有序且復雜的過程，但在各種系統或局部因素作用下，這種有序的過程被破壞，導致了慢性難愈創面的發生。造成此種破壞的因素歸納起來主要有以下五點：①營養不良；②組織灌注不良和缺血再灌注損傷；③細菌負荷、感染和壞死組織存留；④糖尿??；⑤細胞衰老。在上述因素的影響下，創面修復能力被削弱，而以損傷因素為主導，最終導致了難愈創面的形成。

1創面愈合的治療方法

迄今為止，在慢性難愈性創面的治療方面，臨床上尚缺乏非常有效的方法。19世紀初發明的封閉負壓引流技術（vacuum assisted closure， VAC）至今仍為臨床所用，但該治療方法的禁忌證廣泛，治療效果也存在較多爭議[3]；創面應用敷料治療技術，目前已有各種成熟的產品，但其對面積大，損傷程度較深的創面，效果仍然有限[4]；高壓氧治療，該方法雖已被證實能夠有效改善創面生長環境，促進肉芽組織的形成，然而其體積龐大，成本較高，臨床療效一般，且禁忌證較多；基因治療雖然取得了一定成績，然而多數僅局限于細胞及動物實驗，且其安全性問題尚待研究[5]；干細胞移植雖然應用于動物正常創面可以加速愈合，但是應用于慢性創面的動物模型及臨床的效果卻并不理想且成本較高[6]；手術治療的效果并不確切，也為患者帶來較大的痛苦及負擔；而中醫復方藥具有多靶點多途徑的復合作用等特點，且價格低廉、使用方便、適用廣泛，但是其在創面愈合方面的作用機制卻未能得到科學深入的闡述而影響了它的推廣應用。

過去的30多年，血清中的生長因子被普遍認為是創面愈合的始動因素：絲裂原和運動因子，如：表皮生長因子/轉化生子因子 （EGF/TGF ），角質細胞生長因子（KGF），白介素-1（IL-1）等能夠促進角質形成細胞的遷移及上皮化而促進創面愈合；血小板源性生長因子（PDGF-BB）和/或血管內皮生長因子（VEGF）等能夠誘導成纖維細胞和血管內皮細胞遷移，促進創面纖維增生和新生血管形成[7-8]。自從1989年EGF第一次被報道用于創面愈合臨床實驗研究以來，許多生長因子也相繼用于創面愈合臨床實驗；研究報道大部分生長因子在創面愈合中都有作用[9-10]，最終卻只有PDGF-BB被美國FDA批準用于臨床治療[11-12]。然而，研究發現PDGF-BB用于創面治療療效低、花費高、副作用大等，臨床應用受限[13]。這表明血清中的生長因子可能并不是創面愈合中促進細胞遷移的來源，使得傳統的觀念認為生長因子是促進創面愈合的主要驅動力量受到質疑和挑戰[14]。

2Hsp90α與創面愈合

2.1 HSP90α的發現：胎牛血清常被用于創面愈合的各種細胞培養，但研究發現在培養的細胞并不與胎牛血清真正的融合，在創面中也是懸浮于血清中。通過觀察胎牛血清及人血清對創面愈合所需的三類細胞即角質形成細胞、成纖維細胞及血管內皮細胞的遷移作用比較，發現胎牛血清能夠同等地促進三類細胞的遷移；而人血清只能促進角質形成細胞的遷移，對成纖維細胞和血管內皮細胞的遷移沒有作用。進一步的研究發現人血清中的TGF-β3 是導致其不能促進真皮細胞遷移的原因。由于血清中豐富的TGF-β3，生長因子如PDGF-BB等不能夠誘導成纖維細胞和血管內皮細胞的增殖和遷移，因此，臨床應用中效果不如體外實驗明顯。通過對損傷后創面中促使愈合的細胞及分子的研究，研究者發現了熱休克蛋白90α（heat shock protein 90α， HSP90α），其不僅能夠同等地促進創面愈合所需三類細胞的遷移，更重要的是，即使在TGF-β3大量存在的創面中，HSP90α促進細胞遷移的作用并不受影響[15]。因此，HSP90α作為一個新奇的因子，成長了創面愈合研究領域的新觀念。

2.2 HSP90α及F-5的作用：體外研究表明在低氧等應激狀態下，角質形成細胞和成纖維細胞分泌Hsp90 至胞外，當這些分泌的Hsp90 迅速聚集達到一個μM的濃度時，會反過來促進細胞的遷移。在小鼠背部全層創面使用重組的HSP90α后，其促進創面愈合的速度比安慰劑快約60%，是PDGF-BB的3倍；而在糖尿病小鼠背部創面運用重組HSP90α后，糖尿病創面愈合的速度明顯優于PDGF-BB。 HSP90α的作用在創面愈合過程中是必不可少的[16-18]。

從治療角度來說，蛋白中小片段的、穩定且具有同樣效應的短肽由于具有高度特異性以及低耗能，因此，比全長的氨基酸片段更容易通過GMP生產管理，故不同長度的HSP90α的截短體也由此而生。通過體外實驗發現含有115個氨基酸（處于HSP90α的中間區域與鏈接區域）的截短體F-5，是目前與全長的HSP90α有同樣的促進細胞運動的最小的氨基酸片段。體內試驗表明F-5加速創面愈合的速度優于PDGF-BB， 并且主要是通過促進上皮化來實現的；而對于糖尿病創面F-5的作用優勢更甚于普通創面，也優于PDGF-BB；F-5能夠將糖尿病小鼠創面愈合的時間由35天縮短至14～18天，并且不是通過血管化或是創面的收縮完成[17]。

2.3 HSP90α及F-5的特性：HSP90α及F-5具有以下特性，因此其促進創面愈合的作用優于生長因子 [17]：首先，HSP90α及F-5是一個公共的能動性因子；即HSP90α及F-5能夠同等地促進3種創面愈合所需的皮膚細胞（表皮角質形成細胞，真皮成纖維細胞和血管內皮細胞）的遷移。皮膚受損后，首先角質形成細胞的橫向移動使創口閉合，之后成纖維細胞和血管內皮細胞遷移至基底修復受損組織及重建血管。因此，一個理想的創面愈合因子應該具有募集創面愈合所需三類細胞的能力，由于創面愈合所需的三類皮膚細胞都能表達不同水平的LRP-1受體 [16]，所以，HSP90α具有此特性。而如果某個因子只能夠對某一類細胞起作用，其對創面愈合這個需要多種細胞參與的過程效果將明顯降低，如生長因子 PDGF-BB，只有成纖維細胞表面能夠表達PDGF受體，所以它只能促進成纖維細胞的遷移。假設體外研究結果與創面愈合過程相類似，那就說明PDGF-BB對表皮角質細胞的上皮化和真皮微血管內皮細胞的血管化并沒有直接的影響；其次，HSP90α及F-5是一個TGF 抵抗因子；由于細胞表面作用的受體具有選擇性，PDGF-BB不能夠抵抗創面中TGFβ3的抑制作用刺激成纖維細胞遷移，因此，在臨床應用中效果并不明顯。然而即使在TGFβ3存在的情況下，HSP90α及F-5同樣能夠有效地促進三類細胞的遷移，但具體作用機制尚待研究；第三，HSP90α及F-5是一個高糖抵抗因子，各種類型的糖尿病都是以血液循環中慢性高血糖為特征，這也是糖尿病創面愈合延遲的主要原因之一[19]。在創面愈合過程中，缺氧誘導因子1α（hypoxia induced factor-1α，HIF-1α）是調節HSP90α分泌的一個關鍵因子，有報道說明高糖能夠損害HIF-1α的穩定性 [20-21]。Cheng等[17]最近研究發現高糖能夠抑制低氧和血清刺激成纖維細胞遷移的作用，而HSP90α及F-5不僅能夠增強在正常血糖水平低氧促進細胞遷移的作用，而且可以拯救高糖狀態下低氧抑制培養的細胞的遷移。這說明HSP90α及F-5促進糖尿病創面的愈合是由于越過了高糖導致的HIF-1α的下調并啟動了細胞的遷移。

基于以上特性，一個新的創面愈合的程序被提出來，并且對驅動表皮和真皮細胞的遷移做出了說明：在受傷之前，皮膚中的HSP90α，TGF-β3和細胞的運動性是保持在最低限度的；受傷后數小時內，角質形成細胞開始水平移動（可能是受到急性缺氧或是血清中TGF-α的誘導），此時，創緣的成纖維細胞和血管內皮細胞由于血清中TGF-β的存在并不能立即向創面基底移動；遷移的角質形成細胞開始分泌HSP90α，當分泌的HSP90α達到100nM的閾值時[22]，即使在TGF-β存在的條件下，成纖維細胞和血管內皮細胞開始從創緣周圍遷移至創基；最后角質形成細胞完全閉合創面，成纖維細胞修復受損組織，血管內皮細胞重建新的血管。組織的重建和血管的新生需要幾月才能完成，因此，角質形成細胞分泌的HSP90α替代了血清中的生長因子，可能真正的募集真皮細胞進入創面的因子。

最后，Hsp90α及F-5是一個運動因子而非絲裂原（不能促進細胞的增殖） [23]，這是因為：①角質形成細胞的遷移在皮膚損傷后立即發生，而真皮細胞的遷移至少4天以后才能被監測 [24] ；②當某個細胞正向著創面區域遷移時，這個細胞并不能同時增殖；局部受損組織所釋放的生長因子刺激表皮和真皮細胞的增殖將會被創面周圍的TGF-β家族細胞因子所抑制[15，17]；③在創面愈合過程中，細胞的遷移優先于細胞的增殖。當創緣的細胞向基底遷移時，這些細胞給它們自己及其后的細胞留下了空間，當與前面移動的細胞失去接觸抑制作用后，后面的這些細胞才開始增殖。細胞增殖的刺激最可能來自于周圍沒有被損傷的血管中的生長因子，因為這些血管中的TGF-β水平很低甚至缺乏。增殖的細胞重新填滿遷移細胞留下的空間而完成創面愈合過程。因此，Hsp90α的作用是盡可能快地促進最初創口的關閉，預防感染及水分丟失，緩解外環境的應激。

3結語和展望

慢性難愈性創面是外科常見疾病，病因繁多、病理復雜，組織再生能力差，治療困難。HSP90α的發現挑戰了傳統的創面愈合觀念，為難愈性創面的治療提供了一個更有效、更安全的因子，對HSP90α的作用及其機制的進一步研究，會有利于我們更深入地了解創面愈合的相關機制，為難愈性創面的治療提供新的思路。

[參考文獻]

[1]Sen CK.Human skin wounds： a major and snowballing threat to public health and the economy[J].Wound Repair Regen，2009，17：763-771.

[2]Gottrup F.A specialized wound-healing center concept： importance of a multidisciplinary department structure and surgical treatment facilities in the treatment of chronic wounds [J].Am J Surg，2004，187 Suppl 5A： S38-43.

[3]Nordmyr J，Svensson S，Bjrck M，et al.Vacuum assisted wound closure in patients with lower extremity arterial disease.The experience from two tertiary referral-centres[J].Int Angiol，2009，28（1）：26-31.

[4]Helberg D，Mertens E，Halfens RJ，et al.Treatment of pressure ulcers： results of a study comparing evidence and practice[J]. Ostomy Wound Manage，2006，52（8）：60-72.

[5]Dong X，Xu J，Wang W，et al.Repair effect of diabetic ulcers with recombinant human epidermal growth factor loaded by sustained-release microspheres[J].Sci China C Life Sci，2008，51（11）：1039-44.

[6]Lin CD，Allori AC，Macklin JE，et al.Topical lineage-negative progenitor-cell therapy for diabetic wounds[J].Plast Reconstr Surg，2008，122（5）：1341-1351.

[7]Mandracchia VJ，Sanders SM，Frerichs JA.The use of becaplermin （rhPDGF-BB） gel for chronic nonhealing ulcers. A retrospective analysis[J].Clin Podiatr Med Surg，2001，18：189-209.

[8]Singer AJ，Clark RA.Cutaneous wound healing[J].N Engl J Med，1999，341：738-746.

[9]Werner S，Grose R.Regulation of wound healing by growth factors and cytokines[J].Physiol Rev，2003，83：835-870.

[10]Grose R，Werner S.Wound-healing studies in transgenic and knockout mice[J].Mol Biotechnol，2004，28：147-166.

[11]LeGrand EK.Preclinical promise of becaplermin （rhPDGF-BB） in wound healing[J].Am J Surg，1998，176：48S-54S.

[12]Steed DL.Clinical evaluation of recombinant human platelet-derived growth factor for the treatment of lower extremity diabetic ulcers. Diabetic Ulcer Study Group[J].J Vasc Surg，1995， 21：71-78；discussion 79-81.

[13]Nagai MK，Embil JM.Becaplermin： recombinant platelet derived growth factor， a new treatment for healing diabetic foot ulcers[J].Expert Opin Biol Ther，2002，2：211-218.

[14]Sarret Y，Woodley DT，Grigsby K，et al.Human keratinocyte locomotion： the effect of selected cytokines[J]. J Invest Dermatol，1992，98：12-16.

[15]Bandyopadhyay B，Fan J，Guan S，et al.A "traffic control" role for TGFbeta3： orchestrating dermal and epidermal cell motility during wound healing[J].J Cell Biol，2006，172：1093-1095.

[16]Cheng CF，Fedesco M，Guan SG，et al.TGF{alpha}-Stimulated Secretion of HSP90{alpha}： Using LRP-1/CD91 Receptor To Promote Human Skin Cell Migration Against TGF{beta}-Rich Environment In Wound Healing[J].Mol Cell Biol，2008，28：3344-3358.

[17]Cheng CF，Sahu D，Tsen F，et al."A fragment of secreted Hsp90α carries properties that enable it to accelerate effectively both acute and diabetic wound healing in mice" [J].J Clin Invest，2011，10：1172-1182.

[18]任靜，曾海峰，栗勇，等.熱休克蛋白90促進糖尿病創面愈合的作用研究[J].中國美容醫學，2010，19（5）：691-699.

[19]Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J].Nature，2001，414：813-820.

[20]Catrina SB，Okamoto K，Pereira T，et al.Hyperglycemia regulates hypoxia-inducible factor-1alpha protein stability and function[J]. Diabetes，200453：3226-3232.

[21]Botusan IR，Sunkari VG，Savu O，et al.Stabilization of HIF-1alpha is critical to improve wound healing in diabetic mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：19426-19431.

[22]Clayton A，Turkes A，Navabi H，et al.Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes[J].J Cell Sci ，2005，118：3631-3638.

[23]Li W，Li Y，Guan S，et al.Extracellular heat shock protein-90alpha： linking hypoxia to skin cell motility and wound healing[J].EMBO J，2007，26：1221-1233.

[24]Singer AJ，Clark RA.Cutaneous wound healing[J]. N Engl J Med，1999，341：738-746.

[收稿日期]2012-08-20[修回日期]2012-10-08

編輯/李陽利