EGCG對中波紫外線輻射后原代人角質形成細胞中光產物產生和清除的影響

林向飛　閔瑋　朱曉芳　駱丹

[摘要]目的：觀察中波紫外線（UVB）輻射后人原代角質形成細胞中環丁烷嘧啶二聚體（cyclobutane pyrimidine dimmers，CPDs）的生成和清除情況，以及沒食子兒茶素沒食子酸酯 （epigallocatechingallate，EGCG）干預對上述過程的影響。方法：以不同劑量UVB照射原代角質形成細胞后并加入EGCG干預處理，采用免疫組織化學法檢測UVB照射后不同時段細胞中CPDs的產生和清除情況。結果： UVB照射后細胞中CPDs開始產生，1h左右達到高峰；CPDs在照光后4h內清除速率較快，4h后清除速率逐漸降低，至24hCPDs被基本清除。照光前后加入EGCG干預減少UVB引起的35.7%～42.9%CPDs產生（P<0.05）。結論：UVB可明顯引起原代人角質形成細胞損傷，受損程度隨輻射劑量增大而加重；EGCG可以減少UVB輻射所致的光產物的產生，加速光產物的清除。

[關鍵詞]UVB輻射；人原代角質形成細胞；環丁烷嘧啶二聚體；EGCG

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）11-1967-04

日光中和皮膚癌相關的紫外線可以分為UVA（320～400nm）、UVB（280～320nm）、UVC（200～280nm）。UVB可導致DNA的標志性損傷即光產物形成[1-2]，包括6-4光產物（（6-4）PPs）和嘧啶或環丁烷嘧啶二聚體（CPDs）。CPDs約占75%左右，是主要的光產物。這些DNA損傷如沒有修復或修復不完善，可以產生基因突變，成為皮膚癌的初始改變。生物體天然固有切除和修復光產物的能力，這種切除修復能力會受到多種外界因素如藥物的影響。現有研究表明綠茶提取物茶多酚（Teapol， TP）中的主要活性成分EGCG具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤和免疫調節等多種作用，既往我們已報道EGCG有較強的抗紫外線能力，但其對UVB輻射后人皮膚原代KC中光產物產生及清除的影響還未見報道[3-6]。本研究主要觀察UVB輻射后人皮膚原代KC中CPDs產生和清除的情況，以及EGCG對上述過程的影響。

1材料和方法

1.1 材料與儀器：EGCG（美國Sigma生物公司）；K-SFM培養基（美國 GIBCO生物公司）；加人中性蛋白酶（Dispase）（美國Sigma生物公司）；CPDs單克隆抗體（美國Sigma生物公司）；免疫組化試劑盒和 DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。SUV-100日光紫外線模擬器及UVB輻照度監示器（上海西格瑪高技術有限公司），EGCG溶液配制濃度為1mg/ml。

1.2 人原代KC的分離與培養：參照文獻方法[4]，將正常成人環切術后的包皮用碘伏浸泡，漂洗3次；剪成0.5cm×0.5cm大小皮片；0.5%中性蛋白酶 4℃下消化16～18h，分離真、表皮；表皮部分用表皮消化液（0.1% 胰蛋白酶：0.01% EDTA=1：1）在37℃下消化10～12min后200目尼龍網過濾，離心，加入K-SFM培養基于37 C、5% CO2下培養。培養的細胞以調整濃度為1×106/ml，定量接種于直徑3.5cm培養皿中繼續培養。待細胞長至70%～80%融合時用于實驗。

1.3 細胞爬片：將24mm×24mm的蓋玻片泡酸、沖洗、烘干、消毒備用。將原代KC調整其濃度為1×106/ml，將無菌蓋玻片放入6孔板中，每張滴加0.6ml細胞懸液繼續培養。細胞80%融合后進行EGCG干預處理及UVB照射。

1.4 UVB照射及EGCG干預處理：將原代KC分為對照組、時間組、劑量組和EGCG處理組。時間組以30mJ/cm2UVB照射，照光后1h、4h、8h、12h及24h進行實驗；劑量組接受不同劑量（30、60和90mJ/cm2）UVB輻射，輻射后4h進行免疫組化實驗；EGCG組以30mJ/cm2UVB輻射，照光前4h及照光后加入200μg/ml EGCG與細胞共孵育，4h后進行檢測。每組設3個平行培養孔。UVB輻照劑量=UVB輻照度×時間（s）。

1.5 免疫組織化學法檢測CPDs：按說明書進行操作。蓋玻片以丙酮液固定，滴加1：1000稀釋的鼠抗人CPDs單抗，以DAB顯色及蘇木素復染，經脫水、透明及封片后顯微鏡下觀察拍照。陽性細胞為胞核棕黃色著色，連續觀察5～10個高倍視野（×400），計數200個細胞總數的陽性細胞數， 采用u檢驗進行統計分析。

2結果

2.1 UVB輻射導致人原代KC中CPDs生成：如圖1A到圖1C所示，UVB輻射可以損傷細胞，引起光產物產生，我們采用免疫組織化學法檢測CPDs的產生情況，有CPDs生成的細胞在圖中表現為具有棕褐色細胞核的陽性細胞。有下圖可見，UVB照射后，出現了大量CPDs陽性細胞，而與照光組相比，非照光組和對照組（以PBS代替一抗作為陰性對照）均未見到陽性細胞。

2.2 UVB輻射后24h內細胞光產物產生和清除情況：原代KC接受UVB輻射后24h內在不同時間點（0、1、4、8、12和24h）檢測CPDs的產生和清除情況，顯微鏡下計數陽性細胞個數，見表1。胞核彌漫性棕褐色著色為陽性細胞，連續觀察5～10個高倍視野（×400），計數200個細胞總數中的陽性細胞數。從圖2A到圖2G中可以看出UVB輻射后光產物產生量逐漸增多，1h左右達到高峰；同時細胞也開始清除光產物，輻射后4h內清除速率較快，輻射后4～24h清除速率逐漸降低，最終光產物被基本清除；各組間差異有統計學意義（P<0.05），表1。

2.3 UVB照射劑量對細胞損傷的影響：原代KC進行細胞爬片，然后接受不同劑量（0、30、60、90mJ/cm2）UVB照射，4h后進行免疫組化實驗。從圖3A到圖3C可以看出，30mJ/cm2UVB照射后鏡下的陽性細胞最少， 60mJ/cm2 UVB對細胞的損傷作用增大，陽性細胞數增多；90mJ/cm2 UVB損傷作用最強，陽性細胞數最多，這顯示UVB對原代KC的損傷作用呈劑量依賴性，各組間差異有統計學意義（P<0.05），表2。

2.4 EGCG對UVB輻射后光產物的產生和清除的影響：從圖4A到圖4C可以看出，UVB輻射前后加入EGCG處理細胞，細胞的損傷均較單純照射組輕，表現為光學顯微鏡下的陽性細胞均較單純照射組少。結果表明EGCG能夠減輕UVB輻射對細胞的損傷，既能減少光產物的產生，也可以加快光產物的清除，各組間差異有統計學意義（P<0.05），表3。

該資料符合Possion分布，對數據進行u檢驗。uEGCG+UVB組>1.96，P<0.05，uUVB+EGCG組>1.96，P<0.05，差別均有統計學意義。

3討論

UVB（280～320nm）誘發紅斑和日曬傷，并與皮膚癌密切相關[7]。表皮細胞DNA直接吸收UVB的能量而產生光損傷。環氧嘧啶二聚體（CPDs）是最主要的DNA光損傷形式[8]，可以導致基因突變如C→T或CC→TT轉換，成為皮膚癌的初始突變。皮膚細胞有多種DNA修復途徑，可以依據紫外線介導不同損傷的類型來去除DNA損傷。UVB輻射產生的CPDs主要由核苷酸切除修復（NER）[9]。

茶多酚是綠茶提取物，其主要有效單體成分為沒食子兒茶素沒食子酸酯 EGCG，它有著廣泛的生物學效應，如抗突變、抗腫瘤形成、抗炎抗病毒及清除自由基和抗氧化等[10]。研究證實，服用綠茶或其提取物（GTP，EGCG）可抑制多種腫瘤的產生[11]。本部分以原代KC為研究對象，采用免疫組織化學方法來觀察和檢測UVB輻射后原代KC中CPDs的產生和清除情況。我們分別檢測了照光后不同時間點的CPDs陽性細胞數量以動態分析CPDs的產生與清除過程，同時還檢測了不同紫外線強度以及加入EGCG干預條件下CPDs生成量的變化。實驗結果表明，UVB輻射可以導致細胞DNA損傷，產生CPDs，照光后1h左右達到高峰。同時細胞自身也清除光產物，在開始的4h內清除速率較快；輻射后4h到24h，CPDs清除速率減慢。我們同時也觀察了不同劑量（30、60、90mJ/cm2）UVB對細胞損傷的影響，結果表明隨著UVB輻射劑量的增大，陽性細胞數目增多，顯示出UVB對原代KC的損傷作用呈劑量依賴性，UVB輻射強度越大，CPDs產生越多；然而，隨著UVB劑量的進一步增大，可能導致細胞直接壞死或凋亡，而不反映為CPDs產生增加，對此我們將在進一步研究中進行觀察和分析。照光前后加入EGCG與細胞共同孵育，鏡下陽性細胞數明顯少于UVB照射組，這證實了EGCG的光保護作用，它可以抵抗紫外線，減少CPDs的產生。UVB輻射后立即分別加入EGCG溶液，與細胞共同孵育4h后進行檢測，光學顯微鏡下陽性細胞數也明顯少于UVB照射組，顯示出EGCG可以加快光產物的清除，對細胞有光保護作用。

總之，UVB輻射可以導致原代KC的DNA損傷，產生光產物（CPDs）。輻射后細胞對光產物的清除存在快速清除期（0～4h），以及隨后的慢速清除期（4～24h）。細胞損傷的程度與UVB輻射的劑量存在著密切關系，隨劑量增大而加重。UVB輻射前后加入EGCG可以減少光產物的產生和加快光產物的清除。

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[收稿日期]2012-06-25 [修回日期]2012-08-20

編輯/張惠娟