人牙周細(xì)胞壓力作用下Hif—1 alpha及Rankl/Opg變化

郭莉　徐靜　郭宏剛

[摘要]目的：探討過大壓力對人牙周膜細(xì)胞三維微球中Hif-1 alpha和Rankl/Opg表達(dá)的影響。方法：體外構(gòu)建人牙周膜細(xì)胞三維微球，壓力組給予0.2 MPa， 4 h靜態(tài)壓力，對照組不給予額外壓力，實(shí)時(shí)定量PCR檢測Hif-1 alpha、Rankl和Opg表達(dá)。結(jié)果：壓力組人牙周膜細(xì)胞微球Hif-1 alpha和Rankl mRNA 表達(dá)增加，而Opg mRNA表達(dá)降低。結(jié)論：過大壓力可以使人牙周膜細(xì)胞上調(diào)Hif-1 alpha并且升高Rankl/Opg mRNA比值，使其分泌的因子向促破骨方向發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]人牙周膜細(xì)胞微球；壓力；Hif-1 alpha ；Rankl/Opg

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）11-1964-03

牙周炎是口腔疾患中的常見疾病，牙槽骨吸收是其的主要臨床表現(xiàn)之一，嚴(yán)重者可導(dǎo)致牙齒松動或脫落。在引起破骨過程中，Rankl/Opg之間的平衡起著主要作用，Rankl作為分泌性因子與破骨前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞膜上表達(dá)的Rank受體結(jié)合而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化、成熟和破骨功能，而Opg是分泌性同Rankl結(jié)合的假受體，其與Rankl結(jié)合而抑制破骨活動[1]。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及體外人牙周膜細(xì)胞二維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)等提示人牙周膜細(xì)胞可能是Rankl/Opg來源而影響牙周炎中牙槽骨的改建[2-7]。咬合創(chuàng)傷常常是牙周炎的協(xié)同致病因素，過大的咬合力量導(dǎo)致牙槽骨吸收，體外試驗(yàn)也顯示人牙周膜細(xì)胞能夠感受機(jī)械信號而調(diào)節(jié)Rankl/Opg表達(dá)[8-14]。Hif-1 alpha是細(xì)胞感受乏氧的重要轉(zhuǎn)錄因子[15]，外界力學(xué)信號也可以改變其表達(dá)[17-19]，而最近研究表明Hif-1 alpha可以直接誘導(dǎo)Rankl的表達(dá)[20]。

采用高密度細(xì)胞自行在非貼壁的瓊脂孔內(nèi)形成無支架的三維細(xì)胞塊已經(jīng)用于軟骨和纖維軟骨的組織工程研究[21-22]，本研究采用高密度的人牙周膜細(xì)胞微球三維培養(yǎng)和壓力加載系統(tǒng)觀察壓力對Hif-1 alpha和Rankl/Opg的影響，以其模擬過大咬合力對牙周膜細(xì)胞在牙槽骨改建中的作用。

1材料和方法

1.1 人牙周膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)：參考[23]的方法，無菌條件下刮取健康男性正畸拔牙的雙尖牙牙根表面中1/3的牙周膜，以組織塊酶消化法得到原代人牙周膜細(xì)胞。牙周膜細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含20%胎牛血清的DMEM。待細(xì)胞匯聚80%左右后，0.25%胰酶消化傳代。P3代的人牙周膜細(xì)胞用于構(gòu)建細(xì)胞微球。

1.2 人牙周膜細(xì)胞微球的構(gòu)建和加壓：參照J(rèn)ohns 等[21]的方法，先將消毒融化的2%的瓊脂糖注入到24孔板的孔內(nèi)，然后將粘有24個(gè)直徑5mm×高10mm的不銹鋼圓柱體蓋板適合于24孔，瓊脂糖在室溫下1h左右結(jié)成凝膠，分離附有不銹鋼圓柱體的24孔板蓋板，形成24孔直徑5mm×高10mm的瓊脂孔，瓊脂孔被完全培養(yǎng)液飽和置換出瓊脂糖內(nèi)含的PBS。每孔把2×106個(gè)P3代人牙周膜細(xì)胞懸于100μl完全培養(yǎng)基中，細(xì)胞不能貼壁于瓊脂糖孔，也不能長入其中，瓊脂孔內(nèi)每天換液50μl， 1w后細(xì)胞將自行聚集形成將人牙周膜細(xì)胞微球。

壓力裝置采用任利玲等[24]的加壓系統(tǒng)，將人牙周膜細(xì)胞微球置于加有完全培養(yǎng)基5 ml注射器中，注射器固定在超凈臺內(nèi)中的加壓裝置上，維持于37℃恒溫水浴箱中。注射器通過活塞運(yùn)動壓縮空氣產(chǎn)生靜水壓作用于人牙周膜細(xì)胞微球。將形成的人牙周膜細(xì)胞微球隨機(jī)分成兩組：壓力組給予0.2 MPa， 4h的靜態(tài)壓力，對照組給予4h除不加力外，其它培養(yǎng)條件同加壓組，加力后進(jìn)行大體觀測，每組設(shè)4個(gè)樣本。

1.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測Hif-1 alpha和Rankl/Opg的表達(dá)：將加力后的人牙周膜細(xì)胞微球用Trizol試劑盒（Invitrogen， Carlsbad， CA， USA）提取總RNA， 按照PrimeScriptR RT Master Mix （Perfect Real Time， Takara， 大連）反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)定量按照PCR SYBRR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time， Takara， 大連）試劑盒利用Applied Biosystems 7500 PCR系統(tǒng)。目的基因的引物序列如下：Hif-1 alpha上游引物： GCTGGCCCCAGCCGCTGGAG，Hif-1 alpha下游引物： GAGTGCAGG GTCAGCACTAC； Rankl上游引物： CGTTGGATCACAGCACATCAG， Rankl下游引物： GTACCAAGAGGACAGACTCAC； OPG上游引物：CACTACTACACAGACAGCTGG， Opg下游引物：ACTCTATCTCAAGGTA GCGCC； Gapdh上游引物：GTCTTCACCACCATGGAGAAG， Gapdh下游引物： GTTGTCATGGATGACCTTGGC。所以基因重復(fù)3次，對其結(jié)果取均值，目標(biāo)基因采用2-△△Ct相對定量的方法，將對照組目的基因設(shè)為1，壓力組與對照組比較得到相對定量值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析：所得數(shù)據(jù)以x±s表示，SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析，選取α=0.05。

2結(jié)果

2.1 加壓后的人牙周膜細(xì)胞微球大體情況：圖1代表性顯示構(gòu)建好的人牙周膜細(xì)胞微球呈大約1mm球樣形態(tài)，加壓組和對照組大體觀沒有明顯差異。

2.2 加壓后的人牙周膜細(xì)胞Hif-1 alpha和Rankl/Opg的mRNA表達(dá)：人牙周膜細(xì)胞微球施加4h0.2Mpa持續(xù)壓力后Hif-1 alpha mRNA水平顯著性上調(diào)，是對照組的2.7倍左右。受壓以后人牙周膜細(xì)胞的Rankl mRNA也明顯上調(diào)，而Opg mRNA卻少許下降，反應(yīng)破骨功能的Rankl/Opg mRNA水平的比值因此在加壓組明顯上升，約是對照組的2.2倍。Rankl/Opg比值的上升，說明0.2MPa持續(xù)壓力使人牙周膜細(xì)胞分泌的因子向促破骨方向發(fā)展。

3討論

本研究結(jié)果顯示，0.2Mpa的持續(xù)壓力會引起人牙周膜細(xì)胞微球Hif-1 alpha和Rankl的mRNA 表達(dá)增加，而抑制Opg mRNA的表達(dá)，從而Rankl/Opg mRNA比值升高，使人牙周膜細(xì)胞分泌的因子向促破骨方向發(fā)展。

Hif-1 alpha即缺氧誘導(dǎo)因子-1 alpha，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過大機(jī)械刺激會使軟骨細(xì)胞中Hif-1 alpha表達(dá)增高[19]，而體外機(jī)械力作用肌腱成纖維細(xì)胞也會上調(diào)其表達(dá)[17]。最近體外報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示Hif-1 alpha可以直接上調(diào)Rankl[20]，進(jìn)一步提示Hif-1 alpha轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)節(jié)Rankl的分泌而影響破骨活動。這與本研究的結(jié)果一致，0.2MPa可能代表過大的咬合力，從而使人牙周膜細(xì)胞微球的內(nèi)環(huán)境改變而影響Hif-1 alpha的上調(diào)，提示它可能與促進(jìn)Rankl表達(dá)增高有關(guān)。

牙槽骨的嚴(yán)重吸收是牙周炎晚期的主要表現(xiàn)，而牙周膜細(xì)胞分泌的Rankl/Opg是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能的一對重要因子。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)提示牙周膜細(xì)胞分泌的Rankl/Opg的比值增加可能與牙周炎密切相關(guān)[2-7]。本研究發(fā)現(xiàn)0.2MPa持續(xù)壓力可以促進(jìn)Rankl表達(dá)而一致Opg表達(dá)，從而有利于破骨，這與大多數(shù)體外機(jī)械刺激牙周膜細(xì)胞的結(jié)論一致[8-14]，可能是過大壓力原因，而其他的研究者發(fā)現(xiàn)合適的機(jī)械刺激也會抑制牙周膜細(xì)胞的破骨因子分泌[25-26]。本研究采用純牙周膜細(xì)胞微球的三維培養(yǎng)[21-22]和壓力裝置[23]，較體外單層培養(yǎng)有一定的優(yōu)勢，雖然不能用來研究牙周膜細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)，這與Bloemen 等[2]的研究成纖維細(xì)胞對破骨細(xì)胞影響的方法不一樣，但是牙周細(xì)胞微球加壓后的條件培養(yǎng)液可以用于體外模擬牙周膜細(xì)胞分泌的因子對破骨細(xì)胞功能的研究，這尚需進(jìn)一步研究。

縱上所述，異常的機(jī)械壓力可能上調(diào)人牙周膜細(xì)胞的Hif-1 alpha和Rankl而抑制Opg表達(dá)而發(fā)揮促破骨功能，這可能是導(dǎo)致晚期牙周炎牙槽骨吸收的原因之一，而其具體機(jī)制尚需深入研究。

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[收稿日期]2012-08-11[修回日期]2012-10-10

編輯/張惠娟