IGF—ⅠR信號通路在西妥昔單抗抗HepG2細胞增殖中的作用

韓春蕃 陳瑩蓉 蔡煒龍(等）

[摘要] 目的 探討IGF—ⅠR信號通路在西妥昔單抗抗HepG2細胞增殖中的作用。 方法 選用濃度遞增的西妥昔單抗（5～500） mg/mL、胰島素樣生長因子（IGF）（2.5～250） μmol/L及其抑制劑aIR3（2.5～250） μmol/L，單獨或聯合作用于HepG2細胞，觀察IGF與aIR3對西妥昔單抗抗HepG2增殖的影響。 結果 細胞培養72 h后，單藥西妥昔單抗對HepG2細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性，西妥昔單抗聯合aIR3組增殖抑制率在相應濃度下均顯著高于同濃度的西妥昔單抗組（均為P < 0.01），IGF（10～250） μmol/L與西妥昔單抗（20～500） mg/mL聯合組增殖抑制率均顯著低于相應濃度的西妥昔單抗組（均為P < 0.01）。 結論 IGF—ⅠR通路可影響西妥昔單抗抗HepG2細胞增殖的作用，可能是肝癌細胞株對西妥昔單抗耐藥的機制之一。

[關鍵詞] 肝癌細胞株；表皮生長因子受體；西妥昔單抗；胰島素樣生長因子—Ⅰ受體

[中圖分類號] R735.7[文獻標識碼] A[文章編號] 1673—9701（2012）25—0002—03

Role of IGF—ⅠR signaling pathway in the anti—proliferation of cetuximab to HepG2 cells

HAN Chunfan1 CHEN Yingrong2 CAI Weilong1 XIE Zhonghai1 WANG Yan1 SHEN Hua1 MIN Lishan2 WEI Feng1 DAI Licheng2

1.Department of Surgery， Huzhou Central Hospital， Huzhou 313000， China； 2.Huzhou Key Laboratory of Molecular Medicine， Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To investigate the role of IGF—ⅠR signaling pathway in the anti—proliferation of cetuximab to HepG2 cells. Methods Increasing concentrations of cetuximab （5—500） mg/mL， insulin—like growth factor （IGF） （2.5—250） μmol/L and its inhibitor aIR3 （2.5—250） μmol/L， alone or in combination were administrated to HepG2 cells. The inhibitory effects of the drugs on cell proliferation were observed. Results After 72 h cell culture， the single agent of cetuximab inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose—dependent manner. The growth inhibition rates of cetuximab combined aIR3 group at the corresponding concentrations were significantly higher than that of cetuximab group （all P < 0.01）. However， the proliferation inhibition rates of IGF （10—250） μmol/L combined cetuximab （20—500） mg/mL were significantly lower than that of cetuximab group （all P < 0.01）. Conclusion IGF—ⅠR pathway can affect the anti—proliferation of cetuximab to HepG2 cells， which may be one of the mechanisms of hepatocellular carcinoma cell lines resistance to cetuximab.

[Key words] Hepatocellular carcinoma cell lines； Epidermal growth factor receptor； Cetuximab； Insulin—like growth factor—Ⅰ receptor

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，惡性程度與死亡率均很高。外科手術是其主要治療方法，但術后易復發轉移，傳統的放、化療療效不佳，因此總體臨床療效不滿意。生物靶向治療為惡性腫瘤提供了新的治療手段。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）幾乎在所有實體瘤中均有表達。肝癌細胞中同樣有EGFR的過表達，并常與肝癌侵襲、轉移、放化療抗性等生物學特性有密切關系。研究發現，EGFR抑制劑如西妥昔單抗對肝癌細胞具有明顯的體內外抑制作用[1]。但部分患者對此類藥物無明顯效果，部分患者最終產生耐藥，盡管機制并不完全明確[2]，其中胞內許多不同信號通路的改變是產生耐藥性的重要機制，而胰島素樣生長因子—Ⅰ受體（insulin—like growth factor—Ⅰreceptor，IGF—ⅠR）通路則是其中重要的信號通路[3]。本文通過在西妥昔單抗抑制人肝癌細胞株HepG2增殖的實驗體系中，分別加入促進或抑制IGF—ⅠR信號通路的試劑，探討IGF—ⅠR信號通路在前者中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

西妥昔單抗、IGF—ⅠR抑制劑aIR3與IGF均購自德國默克制藥公司，CCK—8細胞計數試劑盒產自日本同仁化學研究所，RPMI—1640細胞培養液、10%新生小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的雙抗、0.25%胰酶溶液購自美國Gibco公司，分析純二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養

人肝癌細胞株HepG2購自中科院上海細胞所，細胞培養液為含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI—1640培養液，培養于37℃、5%CO2、85%濕度的培養箱，每3～4天傳代1次，細胞于對數生長期時開始實驗。

1.3 細胞生長抑制實驗

分為5組，包括空白對照組、細胞對照組、西妥昔單抗組、IGF和西妥昔單抗聯合組、aIR3和西妥昔單抗聯合組，每組設3個復孔。HepG2細胞用0.25%胰酶溶液消化，用RPMI—1640培養液稀釋并接種于96孔培養板，使其密度為3×104/mL，置于恒溫箱中培養。西妥昔單抗單用時選取7個依次遞增的濃度[（5～500）mg/mL]處理細胞，兩藥聯用時，按照藥物聯合作用實驗原則，加入孔內的藥物濃度亦同時遞增，且兩藥間濃度比例保持恒定[西妥昔單抗（5～500）mg/mL，IGF（2.5～250）μmol/L，aIR3（2.5～250）μmol/L]。分別培養24 h、48 h、72 h，應用全自動酶標儀測定各孔吸光度值（A值），并計算細胞增殖抑制率。

1.4 統計學方法

計算各組細胞增殖抑制率均數，以均數±標準差（x±s）表示，采用雙側t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 西妥昔單抗單藥或聯合aIR3對HepG2細胞增殖的影響

西妥昔單抗單藥或聯合aIR3與HepG2細胞培養72 h后，單藥與聯合組的增殖抑制率均隨劑量增加而升高，但在相應濃度下，西妥昔單抗聯合aIR3組增殖抑制率均顯著高于同濃度的西妥昔單抗組（均為P < 0.01），見表1、圖1，提示aIR3可協同西妥昔單抗對HepG2細胞的增殖抑制作用。

2.2 西妥昔單抗單藥或聯合IGF對HepG2細胞增殖的影響

西妥昔單抗單藥或聯合IGF與HepG2細胞培養72 h后，西妥昔單抗單藥組的增殖抑制率隨劑量增加而升高，二藥聯合組增殖抑制率無顯著變化。IGF在（10～250）μmol/L濃度范圍內，西妥昔單抗在（20～500）mg/mL濃度范圍內，兩藥聯合組增殖抑制率均顯著低于相應濃度的西妥昔單抗組（均為P < 0.01），見表2、圖2，表明IGF可拮抗西妥昔單抗對HepG2細胞的增殖抑制作用。

3 討論

近年來，分子靶向治療技術的飛速發展為肝癌提供了一個新的治療途徑，隨著國內外研究的不斷深入，涌現出了許多針對不同細胞表面分子的新型靶向治療藥物，而EGFR抑制劑則是最受關注的領域之一。EGFR屬受體酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）erbB/HER家族。它含有3個結構域：胞外受體結合區、跨膜區及含酪氨酸激酶結構域的胞內區。受體結合相應配體后發生二聚化，使細胞內酪氨酸殘基發生磷酸化，進而募集并活化信號復合體，激活其下游信號轉導蛋白。對腫瘤細胞的生物學作用包括調節侵襲、轉移、血管生成、生長及轉化。EGFR高表達見于多種惡性腫瘤，且EGFR高表達的惡性腫瘤患者預后不良[4]。肝癌細胞中也常有EGFR的表達，并與肝癌患者的臨床分期、肝內外轉移及組織分化程度等有關[5]。

目前已成功開發出可用于臨床治療的兩類EGFR抑制劑，包括小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI）與單克隆抗體（mAb）[6]。mAb通過競爭性地與相應配體結合，阻止該配體與受體結合，從而抑制后者酪氨酸激酶的激活與下游信號通路的活化。TKI與EGFR結合后，可阻斷ATP與TK結構域的結合，使其受體無法磷酸化，信號傳導通路中斷，但不引起EGFR內化[7]。大量臨床前研究及臨床資料證實，EGFR抑制劑能夠有效抑制腫瘤增殖。但EGFR抑制劑在臨床應用中已出現了耐藥現象，其產生耐藥的機制仍未完全明確，其中繞開EGFR通路的其他TK受體的活化被認為是產生耐藥性的重要機制，而IGF—ⅠR通路則是一條重要旁路[3，7]。

胰島素樣生長因子Ⅰ型受體（IGF—ⅠR）在多種細胞廣泛表達，對調節正常細胞的多種生物學功能起關鍵作用。但其過度表達可使細胞向惡性轉化，已見于多種惡性腫瘤。IGF—ⅠR介導的信號通路在促有絲分裂活性、細胞惡性轉化外、抗細胞凋亡等方面有重要作用。IGF—ⅠR單克隆抗體aIR3對腫瘤的抑制作用已有不少報道[8]。aIR3可通過阻滯細胞于G0/G1期、誘導細胞凋亡等作用抑制肝癌細胞增殖。此外，aIR3除可抑制IGF—ⅠR功能及其下游絲氨酸/蘇氨酸Akt的磷酸化，還可通過溶酶體依賴與非依賴途徑降解IGF—ⅠR[9]。aIR3封閉IGF—ⅠR，在體外可消除IGF—ⅠR促增殖、抑制凋亡的作用，從而抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，達到治療目的。

在本組資料中，EGFR抑制劑西妥昔單抗作用于人肝癌細胞株HepG2后，對其增殖抑制作用呈現明顯的劑量依賴性，在此基礎上加入不同濃度的IGF—ⅠR抑制劑aIR3后，二者對HepG2細胞增殖的抑制率呈現出明顯的協同作用。但在加入（10～250）μmol/L IGF后，則明顯拮抗西妥昔單抗對HepG2細胞的增殖抑制作用。表明IGF—ⅠR通路可影響西妥昔單抗抗HepG2細胞增殖的作用，這可能是肝癌細胞株對西妥昔單抗耐藥的可能機制之一。但IGF—ⅠR與EGFR下游信號通路如何相互影響導致西妥昔單抗耐藥的詳細機制還需進一步深入研究。

[參考文獻]

[1]呂汪霞，馬勝林. 西妥昔單抗的臨床研究新進展[J]. 醫學綜述，2010，16（9）：1345—1348.

[2]Jalal S，Waterhouse D，Edelman MJ，et al. Pemetrexed plus cetuximab in patients with recurrent non—small cell lung cancer （NSCLC）： a phase Ⅰ/Ⅱ study from the Hoosier Oncology Group[J]. J Thorac Oncol，2009，4（11）：1420—1424.

[3]Chakravarti A，Loeffler JS，Dyson NJ. Insulin—like growth factor receptor Ⅰ mediates resistance to anti—epidermal growth factor receptor therapy in primary human glioblastoma cells through continued activation of phosphoinositide 3—kinase signaling[J]. Cancer Res，2002，62（1）：200—207.

[4]Rubin Grandis J，Melhem MF，Gooding WE，et al. Levels of TGF—α and EGFR protein in head and neck squamous cell carcinoma and patient survival[J]. J Natl Cancer Inst，1998，90（11）：824—832.

[5]徐立，張昌卿，馮凱濤，等. 肝細胞癌及癌旁肝組織EGFR和EGFR vⅢ的表達及其臨床意義[J]. 中山大學學報（醫學科學版），2006，27（4）：467—471.

[6]Mendelsohn J，Baselga J. Epidermal growth factor receptor targeting in cancer[J]. Semin Oncol，2006，33（4）：369—385.

[7]王洪波，陳曉光. EGFR抑制劑耐藥機制研究的新進展[J]. 國際藥學研究雜志，2007，34（5）：347—350，355.

[8]Hailey J，Maxwell E，Koukouras K，et al. Neutralizing anti—insulin—like growth factor receptor 1 antibodies inhibit receptor function and induce receptor degradation in tumor cells[J]. Mol Cancer Ther，2002，1（14）：1349—1353.

[9]Lu Y，Zi X，Zhao Y，et al. Insulin—like growth factor—Ⅰ receptor signaling and resistance to trastuzumab （Herceptin）[J]. J Natl Cancer Inst，2001，93（24）：1852—1857.

（收稿日期：2012—05—08）