孢子型乳酸菌對常用抗生素耐藥性及最低抑菌濃度測定

曾衛軍,李杰

摘要：利用ＭＲＳ選擇性培養基，從商業產品倍健素中分離出其主要成分孢子型乳酸菌。通過藥敏紙片法測定其在體外對臨床常用抗生素的敏感性及對飼料常用添加抗生素的ＭＩＣ值，以指導臨床用藥及飼料藥物添加，同時進行質粒抽提研究。結果表明，該菌株對于多種臨床常用抗生素較為敏感，致使這些抗生素與該產品不能同時使用，大大降低了臨床抗生素的使用范圍。但質粒抽提結果表明，該菌株不含有任何耐藥性質粒，即該菌株用于益生保健產品的開發，具有分子生物學參考意義。

關鍵詞：孢子型乳酸菌；藥敏試驗；ＭＩＣ值；質粒

中圖分類號：Ｓ８５４．５＋２文獻標識碼：B文章編號：１００７－２７３Ｘ（２０12）03-0018-02

倍建素是由湖南普菲克生物科技有限公司開發的一種微生態制劑，其主要成分是孢子型乳酸菌（Ｂａｃｉｌｌuｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ，８０億ＣＦＵ／ｇ），是集乳酸菌和芽孢菌的雙重優勢的益生菌產品。研究表明，乳酸菌對于多數腸道菌如大腸桿菌、沙門氏菌等所引起的動物腹瀉有較好的預防和保護作用［１，２］。目前臨床上對于抗生素的使用還十分廣泛［３］，為了防止臨床所用抗生素對孢子型乳酸菌產生抑制作用，對該菌的耐藥性進行分析，對臨床抗生素的使用具有十分重要的指導意義。另一方面，隨著分子生物學的不斷深入，證實許多細菌攜帶有耐藥性質粒［４］。而這些質粒在細菌與細菌之間通過接合轉移的方式，傳播到其他細菌中，導致受體菌產生耐藥性［５］。因此，了解該細菌是否攜帶有耐藥性質粒，對于預防耐藥性的傳播具有舉足輕重的作用。本試驗采用ＭＲＳ選擇培養基從產品中分離出乳酸桿菌，采用藥敏紙片法檢測其對臨床常用抗生素的耐藥性，進而分析該菌攜帶質粒的情況，一方面指導臨床用藥，另一方面可以確定該菌用于益生保健產品中的合理性。

１材料與方法

１．１試驗材料

１．１．１指示菌大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；ＡＴＣＣ３５２１８），金黃色葡萄球菌（Ａｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓｉｓ ａｕｒｅａｓ；ＡＴＣＣ２９２１３），糞腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ；ＡＴＣＣ２９２１２）。

１．１．２試驗樣品來源倍健素（孢子型乳酸菌）購自湖南普菲克生物科技有限公司。

１．１．３藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

１．１．４其他藥品由市場購買。

１．１．５培養基乳酸菌分離培養用ＭＲＳ液體培養基及固體培養基。指示菌培養用營養瓊脂、普通肉湯。

１．２試驗方法

１．２．１乳酸菌的分離將樣品無菌取出１ｇ，用無菌水稀釋后接種于ＭＲＳ液體培養基進行細菌富集培養２４ｈ。然后劃線于ＭＲＳ固體培養基上，培養２４ｈ后挑取單個菌落進行純化，以獲得純菌。

１．２．２藥敏試驗根據美國臨床實驗室標準化委員會（ＮＣＣＬＳ）標準２００５版的規定，采用藥敏紙片進行耐藥性測定。用牙簽無菌蘸取純培養物菌液，均勻地涂布于整個平板表面，放置約１０～１５ｍｉｎ，待表面干燥后貼上藥敏紙片，于３７℃培養２４ｈ后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

１．２．３飼料中常用抗生素ＭＩＣ值的測定采用微量肉湯稀釋法，連續倍比稀釋，再每管加菌液０．１ｍＬ，第１至６孔藥物濃度最終分別為２５６、１２８、６４、３２、１６、８μｇ／ｍＬ。其中，第７孔為不含藥物的空白對照。將接種好的試管密封，置３７℃恒溫箱中孵育１６～２０ｈ，觀察結果。

１．２．４質粒提取參照文獻［６］進行操作。

２結果

２．１藥敏試驗結果

通過藥敏紙片法對乙酰甲喹（痢菌凈）、呋喃唑酮（痢特靈）、利巴韋林（病毒唑）、芬苯達唑、泰妙菌素、復方新諾明（磺胺類）、頭孢哌酮、青霉素Ｇ、多粘菌素Ｂ、慶大霉素、環丙沙星、鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星等１４種抗生素進行耐藥性測定，結果見表１。結果顯示，孢子型乳酸菌對于頭孢哌酮、復方新諾明、環丙沙星、氟苯尼考、恩諾沙星都是極敏感，而只有對利巴韋林、芬苯達唑、乙酰甲喹、泰妙菌素為不敏感，這顯示在臨床用藥時，應注意在使用孢子型乳酸菌的同時，應避開頭孢哌酮、復方新諾明、環丙沙星、氟苯尼考、恩諾沙星等極敏感藥物，同時應避免同時使用慶大霉素、呋喃唑酮、鏈霉素等高敏感藥物，以防止這些藥物致使孢子型乳酸菌不能達到其預期的預防保護效果。為了確保該產品的效果，應盡量使用利巴韋林、芬苯達唑、乙酰甲喹、泰妙菌素等不敏感藥物，在不與其他致病菌耐藥情況相沖突的情況下亦可考慮使用多粘菌素Ｂ、青霉素Ｇ等中敏感藥物。

２．２ＭＩＣ值測定結果

通過肉湯稀釋法，對飼料藥物添加劑金霉素、硫酸粘桿菌素Ｅ（抗敵素）、吉他霉素、喹乙醇、喹烯酮、土霉素、鹽霉素、新霉素、桿菌肽鋅、那西肽、維吉尼霉素（速大肥）、黃霉素、恩拉霉素、地克珠利等１４種抗生素的ＭＩＣ值進行測定，結果見表２。由表2可見，該菌對喹乙醇十分敏感，在３２μｇ／ｍＬ的藥物濃度下就不能生長，其次是土霉素（ＭＩＣ＝６４μｇ／ｍＬ），金霉素（ＭＩＣ＝２５６μｇ／ｍＬ）。而孢子型乳酸菌對于其他藥物皆不敏感，其ＭＩＣ值皆大于２５６μｇ／ｍＬ。

２．３質粒提取結果

在細菌純化過程中，挑取１０株單個菌落進行增菌培養，然后進行質粒攜帶情況分析。分析結果表明，該細菌不存在質粒，即該細菌不攜帶耐藥性質粒，沒有傳播耐藥性的潛在可能性。因此該細菌用于益生保健產品具有分子生物學參考意義。

３討論

本試驗從商業產品倍健素中分離出其主要成分孢子型乳酸菌，通過藥敏紙片法測得該菌對頭孢哌酮等３５．７％的已檢藥物為極度敏感，對慶大霉素等２１．４％的已檢藥物為高度敏感，對于多粘菌素Ｂ等１４．３％的已檢藥物為中度敏感，對于利巴韋林等２８．６％的已檢藥物不敏感。指示臨床在運用孢子型乳酸菌的同時運用抗生素藥物防治其他細菌性疾病時，在不與其他致病菌耐藥性相沖突的前提下，只有２８．６％的藥物可用。若用其他本試驗已測藥品進行預防或冶療時，或可以將倍健素產品中的主要成分孢子型乳酸菌殺死，而達不到應用微生態產品的預期保健目的。對于飼料藥物添加劑的ＭＩＣ值測定結果表明，喹乙醇（ＭＩＣ＝３２μｇ／ｍＬ）、土霉素（ＭＩＣ＝６４μｇ／ｍＬ）、金霉素（ＭＩＣ＝２５６μｇ／ｍＬ）等部分藥物在較低濃度即可以抑制孢子型乳酸菌的生長繁殖，應加以注意。質粒提取試驗表明，倍健素產品中的孢子型乳酸菌不攜帶任何質粒，亦即表明孢子型乳酸菌中不含有任何耐藥性質粒。將孢子型乳酸菌應用于益生保健產品，沒有耐藥性質粒轉接和傳播的潛在可能，具有分子生物學參考意義。

乳酸菌為兼性厭氧菌，在其生長過程中可消耗腸道內游離的氧，同時可以定殖于腸道，從而發揮菌膜屏障和化學屏障的作用；同時又可以產生有利于消化的酶、酸，從而達到保護腸道的目的［７，８］。隨著國內臨床觀念由“冶”向“防”的轉變，像倍健素這樣的產品將會越來越受到養殖業的青睞，具有廣闊的發展前景。

參考文獻：

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［２］趙玲艷，鄧放明，楊細平，等．生物防腐劑—乳酸菌素［Ｊ］．中國食物與營養，２００５（２）：２７－２９．

［３］藏金燦．細菌耐藥性機制與臨床合理用藥［Ｊ］．安徽農業科學，２００７，３５（５）：１３７７－１３７９．

［４］張杰，王辰．肺部感染細菌耐藥現狀［Ｊ］．中華醫院感染學雜志，２００２，１２（１）：７９－８０．

［５］ＬＥＣＬＥＲＣＱ Ｒ，ＤＥＲＬＯＴ Ｅ，ＤＵＶＡＬ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｓｍｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ ｉｎ ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９８８，３１９（３）：１５７－１６１．

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［８］黃紅，張伶俐，辛學瓊．淺談乳酸菌素的作用機理及應用［Ｊ］．職業衛生與病傷，２００４，３（１９）：２２９－２３０．