乙酰水楊酸在UVB誘導黑素細胞樹突形態相關分子Rac1和RhoA表達中的作用

惠坤,簡強,薛柯,朱東寧,安慶,李承新

[摘要]目的：探討乙酰水楊酸（acetylsalicylic acidASA）在UVB誘導黑素細胞樹突形態相關分子Rac1和RhoA表達中的作用。方法：培養正常人表皮黑素細胞系PIG1細胞，將細胞以一定密度接種于平皿中，并隨機分為三組，對照組、100mJ UVB照射組及UVB照射后ASA處理組。ASA處理24h后采用RT-PCR 檢測Rac1和RhoA mRNA表達的變化及Western blot檢測蛋白表達的變化。結果：PIG1細胞經100mJ UVB照射后與對照組相比，促進樹突形成的Rac1表達較對照組明顯增高，而抑制樹突形成的RhoA表達下調；ASA處理可反轉UVB照射對Rac1和RhoA的作用， Rac1表達較UVB照射組明顯降低，而RhoA表達增高。結論：一定劑量UVB照射后，黑素細胞Rac1表達增高，RhoA表達下調；ASA可以抑制一定劑量UVB照射誘導的黑素細胞樹突形態相關分子的改變。

[關鍵詞]黑素細胞；UVB照射；ASA；樹突；Rac1；RhoA

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）04-0587-03

Effect of ASA on the expression of the dendrites regulating factors Rac1 and RhoA in melanocytes induced by UVB irradiation

HUI Kun,JIAN Qiang,XUE Ke,ZHU Dong-ning,AN Qing,LI Cheng-xin

(Institute of Dermatology,Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of acetylsalicylic acid (ASA )on the expression of the dendrites regulating factors Rac1 and RhoA in melanocytes induced by UVB Irradiation.MethodsMelanocytes cultured in plates were divided into 3 groups, control group, 100mJ UVB irradiation group and UVB irradiation plus ASA treatment group, respectively.The mRNA expression of Rac1 and RhoA was analysed with real time RT-PCR, and protein expression was assayed by western blotting.ResultsCompared with control group, UVB irradiation enhanced the protein and mRNA expression of Rac1,while decreased the expression of RhoA. However, ASA treatment could inhibit the influence of UVB irradiation on the Rac1 and RhoA. The protein and mRNA expression of Rac1was decreased obviously and expression of RhoA was enhanced after treatment with ASA.ConclusionsUVB irradiation can increase the expression of Rac1 and decrease the expression of RhoA in melanocytes and ASA can suppress these change induced by UVB irradiation.

Key words:melanocyte;UVB irradiation;ASA;Rac1;RhoA;dendrites

色素沉著的過程十分復雜，其中黑素的合成與轉運是最為重要的兩個環節。UVB照射不僅能夠增加黑素合成，本課題組先前的實驗證明其還可以明顯促進黑素小體的轉移及轉運。目前有研究表明，乙酰水楊酸（acetyl salicylic acid，ASA）具有淡化色斑的作用，但ASA是否能夠影響UVB誘導的黑素小體的轉運尚不清楚。本實驗檢測ASA對UVB誘導黑素細胞樹突形態相關分子的影響，探討ASA在黑素小體轉運中的作用。

1材料和方法

1.1材料：永生化的人表皮黑素細胞系PIG1來自美國艾利諾斯州Loyola醫學中心，254培養基、HMGS添加劑（Cascade Biologics公司），標準胎牛血清、Trizol核酸提取液（GibcoBRL），ASA、胰蛋白酶（Sigma公司），RT-PCR試劑盒（Takara公司），BCA蛋白定量檢測試劑盒（Pierce公司），兔抗人Rac1單抗、鼠抗人RhoA單抗（abcam公司），山羊抗鼠二抗（HRP）（北京中山生物技術有限公司），紫外線光療儀（上海希格瑪公司），輻照度以UVB輻照度監示器標定，UVB劑量=UVB輻照度×時間(s)，均為單次照射。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組：取對數生長期的PIG1細胞消化后以5×105/ml的密度接種于直徑6mm的平皿，隨機分為三組：第一組為對照組，第二組為100mJ UVB照射組，第三組為100mJ UVB照射后即刻給予ASA處理組。具體過程如下：細胞培養至80%融合時吸出254培養液，PBS清洗后，再加入1ml PBS后給予UVB照射，吸出PBS，加入原培養液，第三組原培養液中加入ASA使其濃度為100μM，繼續培養24h。

1.2.2 MTT法測定生長曲線：取接受不同濃度ASA處理后的PIG1細胞進行MTT比色試驗，每孔加入20?l 5mg/m1的MTT溶液終止培養，在CO2孵箱中繼續培養4h后吸去培養液，再每孔加入150μl DMSO，充分振蕩培養板10min，酶標儀在490nm波長下測定各孔吸光度值。

1.2.3 Western blotting 方法檢測蛋白表達水平：收集各組細胞后提取蛋白，進行Western blotting檢測 Rac1和RhoA的表達變化

1.2.4 RNA 抽提與定量RT-PCR：細胞總RNA 提取依照Trizol試劑盒方法進行。 Rac1引物：上游引物CAAGTGTGTGGTGGTGGGAG下游引物TCTGTTTGCGGATAGGATAG，擴增片段為77bp；RhoA引物：上游引物GACTCGGATTCGTT GCCTGA下游引物TGGGAACTGGTCCTTGCTGA，擴增片段為324bp。PCR反應條件為：預變性95℃ 30s，變性95℃ 5s，延伸68℃ 30s，共35個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存。反應結束后確認擴增曲線，溶解曲線和Cr值。采用Livak法以β-actin為標準對結果進行相對定量分析。

1.2.5 統計學分析：實驗數據用x±s表示，照射組與對照組及照射組間比較采SPSS12.0進行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05時認為差異有統計學意義。

2實驗結果

2.1 ASA對細胞活性的影響：不同濃度ASA處理黑素細胞24h后，以藥物濃度為橫軸，以490nm波長下吸光度值為縱軸繪制圖表。細胞活性檢測結果顯示當ASA的濃度在100μM以內對細胞活性沒有影響，而當ASA濃度超過500μM時細胞活性降低,但無統計學意義，當處理濃度為2 500μM時細胞活性明顯降低，并有統計學意義（P＜0.05）(圖1)。

2.2 ASA對Rac1，RhoA蛋白表達的影響：不同處理組中Rac1，RhoA的蛋白表達變化：經100mJ UVB照射后與對照組相比Rac1蛋白表達顯著增加，RhoA表達顯著下降；100mJ UVB照射后即刻給予100μM ASA組與單純UVB照射組相比Rac1蛋白表達顯著降低，RhoA表達顯著增高(圖2)。

2.3 ASA對Rac1，RhoA mRNA表達的影響：100mJ UVB照射組與對照組相比Rac1 mRNA表達顯著增加，而在照射后即刻給予100μM ASA組其表達明顯下降(圖3)；100mJ UVB照射組與對照組相比RhoA mRNA表達顯著降低，而在照射后給予100μM ASA組其表達明顯增加(圖4)。

3討論

3.1 黑素細胞分布于表皮基底層，其主要功能是產生黑素，并將其轉運到鄰近的角質形成細胞。因此樹突是黑素細胞形態學的重要特征性標志，它形成樹枝狀分叉，朝鄰近的角質形成細胞生長，以使黑素細胞將黑素輸送給它們[4]。黑素細胞可以通過增加其樹突數量和長度而更有效地向其鄰近的角質形成細胞轉運黑素，使色素沉著增加。樹突在黑素轉運中起著至關重要的作用，其本身又受到許多因素的調節使其自身的形態結構發生改變。其中，關鍵調控因子是Rho蛋白家族的RhoA和Rac1。Scott等研究發現，RhoA和Rac1在黑素細胞肌動蛋白細胞骨架和樹突形成方面起重要作用[2]。在黑素細胞內，活化Rac1可以促進樹突的形成和延伸，而RhoA具有相反的作用[6]。

3.2 乙酰水楊酸，是環氧合酶的非特異性抑制劑，具有解熱、鎮痛、抗炎、抗風濕、抗腫瘤等作用[7-8]。有研究發現ASA具有淡化炎癥后色素沉著的作用。有文獻報道COX-2抑制劑能抑制αVβ3調節的Cdc42/Rac依賴的內皮細胞的遷移[3]，但Cdc42/Rac并不只與細胞的遷移相關，還與黑素細胞樹突的數量以及形態密切相關，提示COX-2可能通過調節Cdc42/Rac的表達而調控黑素細胞樹突形態以及數量。

3.3 本研究發現，ASA可以抑制UVB照射引起的人黑素細胞系PIG1中Rac1的高表達；并可以改變UVB照射引起的人黑素細胞系PIG1中RhoA的低表達，表明ASA能夠影響黑素細胞樹突形態因子RhoA和Rac1的表達，進而影響樹突的形成及功能，減少黑素小體轉運，從而發揮淡化色斑的作用。

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[收稿日期]2011-11-17 [修回日期]2012-01-28

編輯/張惠娟