LIN28B在結(jié)腸癌中的表達及其臨床意義

龐明輝 王 康 伍 剛 張 偉 董丹丹 帥 平 梁耀澤胡 陽 李 平 李國新*

(1.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院普外科，廣州 510515;2.四川省人民醫(yī)院普外科，成都 610072;3.四川省人民醫(yī)院病理科，成都 610072;4.四川省人民醫(yī)院體檢中心，成都 610072)

LIN28參與形成誘導成體干細胞，它高表達于胚胎干細胞，隨細胞分化而逐漸低表達于分化細胞和成體組織。作為lin28的同源基因，lin28b在肝細胞癌中首先得到克隆，能夠在肝細胞癌中高表達并和細胞過度增生相關(guān)［1］。目前，lin28b被認為是“癌胚基因”，可促進細胞惡性轉(zhuǎn)化并特異高表達于部分進展期腫瘤，如肝細胞癌和結(jié)腸癌［2］。國內(nèi)尚無lin28b表達和結(jié)腸癌關(guān)系的報道。本研究利用EnVision免疫組織化學技術(shù)檢測美國Biomax結(jié)腸癌組織芯片(208例結(jié)腸癌，8例正常組織)和南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院149例手術(shù)切除石蠟切片中l(wèi)in28b的表達并進行染色評分，行χ2檢驗研究其表達強度與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，判斷l(xiāng)in28b在結(jié)腸癌中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1)第一組研究對象:購買西安超英生物公司代理美國Biomax的結(jié)腸癌及正常組織組合微陣列芯片(編號CO2161)，包含208例腫瘤和8例正常結(jié)腸組織的病理信息。該組織芯片樣點直徑1.0mm，厚度5 μm，采用中性甲醛固定。208例結(jié)腸癌中男118例，女90例，年齡24～82歲，平均年齡54.8歲，其高分化腺癌83例，中分化腺癌8例，低分化腺癌4例。Ⅰ期2例，Ⅱ期130例，Ⅲ期46例，Ⅳ期11例。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移153例，伴遠處轉(zhuǎn)移11例，無遠處轉(zhuǎn)移197例。詳見表1。

表1 臨床資料Tab.1 Clinical characteristics of patients/tumors at the time of diagnosis

2)第二組研究對象:在臨床研究倫理學會委員會批準、病人知情同意的情況下，選擇在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院普通外科2003年1月至2004年12月行手術(shù)切除的149例結(jié)腸癌組織標本，10%甲醛固定后石蠟包埋。所有標本均詳細記載病人基本信息，記錄腫瘤TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移情況。其中，男性患者88例，女性61例，年齡19～85歲，平均年齡56.9歲;高分化腺癌70例，中分化腺癌67例，低分化腺癌12例，原位癌1例;TNMⅠ期25例，Ⅱ期65例，Ⅲ期42例，Ⅳ期16例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移97例，遠處轉(zhuǎn)移16例，無遠處轉(zhuǎn)移133例。兩組研究對象均將高、中分化腺癌歸入分化較好組，將低分化腺癌歸入分化較差組。

3)入組與排除標準:

(1)入組標準:①首次因結(jié)腸癌就診，未經(jīng)治療病例;②結(jié)腸單一部位病變;③兩位以上病理醫(yī)師共同確診;④結(jié)腸癌病例有完整的隨訪資料;⑤術(shù)前均未行新輔助放化療。

(2)排除標準:①非首次就診病例;②結(jié)腸多部位病變病例;③家族性腺瘤性息肉及其他結(jié)腸疾病，例如潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸結(jié)核、克隆病等病例;④患有身體其他部位惡性腫瘤的病例;⑤有身體免疫缺陷疾病，例如人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)攜帶者或獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)患者的病例;⑥術(shù)前行新輔助放化療者。

1.2 免疫組織化學檢測

采用EnVision免疫組化技術(shù)(試劑盒購自丹麥Dako公司)檢測組織芯片和石蠟切片中l(wèi)in28b的表達。lin28b一抗購自英國Abcam公司，貨號ab71415，稀釋濃度1∶10，以PBS液代替一抗作陰性對照。由兩名病理科醫(yī)師在雙盲情況下對每個標本進行染色評分。結(jié)果按照如下標準進行判斷:陰性為無色，陽性為細胞質(zhì)染色呈棕黃色。根據(jù)陽性染色細胞百分比計分:高倍鏡下每張切片選擇10個有代表性的視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞共計數(shù)1000個細胞。0分為陽性細胞數(shù)小于或等于5%，1分為陽性細胞數(shù)10%～25%，2分為陽性細胞數(shù)25%～50%，3分為陽性細胞數(shù)大于50%，將0～2分計為低表達，3分為高表達［3］。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。對單元格的期望頻數(shù)均大于1，但有小于1/5的單元格期望頻數(shù)小于5，采用連續(xù)性校正χ2檢驗。采用逐步回歸法進行多因素Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

1)美國Biomax結(jié)腸癌組織芯片免疫組化結(jié)果顯示，lin28b在正常結(jié)腸黏膜組織中均未染色，但在結(jié)腸癌組織中均有染色且隨分化程度的降低，lin28b表達強度增加(圖1)。

圖1 Lin28在美國biomax的組合芯片中的表達(免疫組化染色)Fig.1 Expression Lin28b in colon cancer tissue microarrays detected by immunohistochemistry

2)采用χ2檢驗分析lin28b表達強弱和結(jié)腸癌病理學特征之間的聯(lián)系，結(jié)果證實lin28b表達水平與腫瘤較差分化、較高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.001)，見表2。

表2 組織芯片lin28b表達與結(jié)腸癌臨床病理之間的關(guān)系Tab.2 Expression of lin28b and its relationship with clinical pathology in colon cancer tissue microarrays n(%)

3)為驗證前述美國Biomax結(jié)腸癌組織芯片實驗的可重復性，本研究組進一步在中國南方醫(yī)院的結(jié)腸癌石蠟標本中重復上述實驗并得到一致的結(jié)果，顯示lin28b的表達在西方和中國人群中均與進展期結(jié)腸癌病理學特征(腫瘤較差分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移)有關(guān)，見表3。

4)由于組織芯片來源于美國Biomax公司，獲取的臨床信息有限，且無隨訪資料，所以我們僅對南方醫(yī)院收集到的149例臨床資料及隨訪信息完整的結(jié)腸癌組織切片的資料進行了Logistic多因素回歸分析，將lin28b表達作為因變量，年齡、性別、組織分化程度、TNM分期作為自變量納入回歸方程。逐步回歸分析結(jié)果顯示，僅TNM分期是lin28b高表達的獨立危險因素(OR=6.583，95%CI:2.97～14.59)。

表3 組織切片lin28b表達與結(jié)腸癌臨床病理之間的關(guān)系Tab.3 Expression of lin28b and its relationship with clinical pathology in paraffin-embedded surgically resected colon cancer tissues n(%)

3 討論

lin28基因編碼一種具有冷休克結(jié)構(gòu)域和反轉(zhuǎn)錄病毒型鋅指結(jié)構(gòu)的胞漿蛋白，在秀麗隱桿線蟲中最先發(fā)現(xiàn)，參與維持干細胞“干性”。lin28b是lin28的同源基因，位于6q21，長度為752個堿基，GeneBank編號為NM_001004317。二者編碼的蛋白功能相近，在胚胎干細胞和發(fā)育組織中高表達，隨細胞分化而逐漸低表達，在腫瘤組織中則反常高表達。lin28b實質(zhì)為一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白，大小為27 000，主要通過抑制非編碼的Let-7 microRNA家族來實現(xiàn)其促癌作用［4-7］。lin28b/Let-7通路與多種細胞生物學功能有關(guān)，與多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，其中包括結(jié)腸癌［8］。

國內(nèi)外多項研究認為lin28b多高表達于分化程度低的腫瘤［9-11］。本課題組研究結(jié)果顯示lin28b在正常結(jié)腸組織中未表達，在低分化結(jié)腸腺癌組織中表達較強，高分化組織中表達較弱，這說明隨腫瘤組織分化程度和lin28b表達存在負相關(guān)。Saiki Y等［12］研究發(fā)現(xiàn)lin28表達與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期顯著相關(guān)，本課題組的結(jié)果也證實Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌組織中l(wèi)in28b蛋白的表達顯著高于Ⅰ、Ⅱ期結(jié)腸癌。多因素Logistic回歸分析顯示TNM分期是lin28b高表達的獨立危險因素。因此，可認為結(jié)腸癌TNM分期越晚，lin28b的表達越強。

轉(zhuǎn)移和復發(fā)是結(jié)腸癌患者死亡的主要原因，轉(zhuǎn)移發(fā)生包括細胞與基底膜黏附、細胞外基質(zhì)的降解及細胞的遷出進入血管［13］。Wang Y C 等［14］研究認為lin28b高表達可增加肝癌細胞侵襲能力，蔡民等［15］證實lin28b/Let-7通路對膽囊癌細胞在降解細胞外基質(zhì)及隨后的遷移方面有著重要作用。Klemke M等［16］研究指出lin28通過抑制Let-7合成并上調(diào)Let-7下游癌基因hmga2的表達而最終促進上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，對腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生具有重要意義［17］。本課題組研究結(jié)果顯示lin28b高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示lin28b高表達可能促進結(jié)腸癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移，下一步將采用Transwell實驗從分子水平研究lin28b對結(jié)腸癌細胞遷移及侵襲能力的影響。

綜上，本研究采用免疫組織化學法檢測干細胞相關(guān)因子lin28b在結(jié)腸癌中的表達，結(jié)果顯示lin28b的高表達與結(jié)腸癌低分化、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，其表達水平可作為判斷結(jié)腸癌患者病程進展及預后的重要指標，本研究結(jié)果有望為結(jié)腸癌靶向治療提供新的治療靶點。進一步我們將利用完善的隨訪資料進行l(wèi)in28b表達水平與結(jié)腸癌病人術(shù)后生存及復發(fā)方面的系列研究。

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