纖維素酶高產菌株的選育

山西大學生命科學學院 王興華

蘭州交通大學化學與生物工程學院 孫 盈

纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中（Mandels，1976）。從自然界分離篩選新的纖維素酶高產菌株，可為生產高活性纖維素酶提供新菌種或酶基因（閆峰等，2009）。本試驗從山西大學校園內采集各種樹木和灌木叢下的土樣，菌種經初篩和復篩及紫外誘變，以旨得到纖維素酶高產菌株。

1 材料與方法

1.1 原料及儀器

1.1.1 主要試劑 DNS試劑，羧甲基纖維素鈉，新華定性濾紙，葡萄糖標準溶液，檸檬酸緩沖液。

1.1.2 主要儀器 721可見分光光度計 （上海佑科儀器儀表有限公司），電子天平JA1203N（上海精密科學儀器有限公司），手提式高壓蒸氣消毒器YXQSG46-280型（遼寧省丹東市日用五金廠），臺式恒溫箱振蕩器THZ-82A型（上海躍進醫療器械有限公司），干燥箱101-2型（中華人民共和國上海實驗儀器總廠），水浴鍋（北京市長風儀器儀表公司），離心沉淀器80-2型（上海手術器械廠），顯微鏡（奧林巴斯）。

1.2 培養基

1.2.1 發酵培養基 羧甲基纖維素鈉 （CMCNa）8 g，Na2HPO42.5 g，KH2PO41.5 g，蛋白胨 2.5 g，酵母膏 0.5 g，水 1000 mL，調節 pH 7.0～7.2。

1.2.2 保存培養基（PDA培養基） 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然。

1.2.3 剛果紅-羧甲基纖維素瓊脂培養基 （葉姜瑜，1997）。

1.3 菌種的篩選

1.3.1 土樣采集 在山西大學校園內采集各種樹木和灌木叢下，距土地表面5 cm處的混有枯枝及落葉的土樣，共10份。

1.3.2 菌種的初篩 將不同稀釋倍數的樣品溶液涂布于1.2.3培養基上，30℃培養3～5 d，挑選HC（透明圈直徑與菌落直徑之比）大的菌落，保藏于PDA培養基斜面，以備復篩。

1.3.3 菌株的復篩 從PDA斜面培養基上挑取初篩菌種，按一定的接種比接入發酵培養基上進行發酵培養，30℃恒溫培養4 d后測其纖維素酶活，重復3次取平均值。

1.4 測定方法

1.4.1 粗酶液的制備 將2 mL的無菌水分別倒入12株初篩得到的菌株斜面，之后無菌操作轉入到裝有40mL的CMCNa液體培養基中，于30℃，轉速150 r/min的恒溫搖床中培養4 d。液體發酵液在5000 r/min離心15 min，取上清液為粗酶液。

1.4.2 酶活測定方法

1.4.2.1 酶活的定義 CMC酶活單位定義為：在pH為7.0、溫度為50℃條件下，每30 min水解CMCNa釋放1 mg葡萄糖所需要的酶量為一個酶活單位，以U表示。濾紙酶活單位定義為：在pH為7.0、溫度為50℃條件下，每1 h水解濾紙條釋放1 mg葡萄糖所需要的酶量為一個酶活單位，以U表示。

1.4.2.2 葡萄糖標準曲線繪制 取6支洗凈烘干的20 mL具塞刻度試管，編號后加入葡萄糖標準溶液 0、0.4、0.8、1.2、l.6、2.0 mL， 并依次加蒸餾水2.0、l.6、l.2、0.8、0.4、0 mL， 配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后，向各試管中加入1.5 mL DNS溶液，搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。在520 nm波長下，以1號試管作為空白對照，調零點，測定其他各管溶液的吸光度值（A）并記錄結果。以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標，以吸光度值（A）為縱坐標。

1.4.2.3 酶活力的測定 采用DNS法測定菌株的CMC酶活和濾紙酶活（錢存柔和黃儀秀，1999）。

1.5 紫外線誘變試驗

1.5.1 孢子懸浮液的制備 挑取斜面培養基的一環菌，接入5 mL液體培養基中，放入培養箱中30℃培養24 h。然后在無菌條件下從中吸取125 μL菌液接入另一管5 mL液體培養基中，放入培養箱中培養24 h后從中吸取2 mL菌液至100 mL液體培養基中繼續培養24 h。取出菌液后5000 r/min離心15 min，棄去上清液，用5 mL的無菌生理鹽水洗滌菌體沉淀，倒入裝有45 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，搖床20 min，振蕩搖勻后將菌體稀釋成108個/mL左右的孢子懸浮液，10 mL待用。

1.5.2 紫外線（UV）誘變 將上述配好的待用菌液10 mL于9 cm的平皿內，放入轉子置于磁力攪拌器上，紫外燈（254 nm，30 W）位于培養皿上方 30 cm 處，設定不同的輻射時間（1、2、3、4 min）進行誘變。誘變處理后的菌懸液用無菌水進行梯度稀釋，并涂平板，之后避光培養。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的測定結果 見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 初篩結果 本試驗共篩選出30株能在剛果紅-羧甲基纖維素瓊脂培養基上產生透明圈的菌株，其中HC值＞1的有12株，編號從F1到F12，并對各個菌株的透明圈直徑和菌落直徑進行測量，結果見表1。由表1可知，F1的透明圈直徑最大，菌株F4的菌落直徑最大，菌株F8的HC值最大。

表1 透明圈和菌落的直徑及其比值

2.3 復篩結果 為了進一步研究纖維素分解菌的酶特性，篩選出高酶活的菌株，對初篩的12株菌進行液體發酵4 d，并測定其CMC酶活，結果見表 2。由表 2 可知，F1、F2、F3、F5、F6、F8 具有較高的酶活，通過初篩結果可知，這6株菌在初篩試驗中透明圈直徑和菌落直徑也有較大的比值。

表2 不同菌株酶活測定結果

2.4 菌株的紫外誘變試驗結果

2.4.1 紫外誘變致死率 菌懸液在紫外燈輻射不同時間后，按不同稀釋梯度涂布于剛果紅-羧甲基纖維素培養基，30℃避光培養24 h，計算菌株死亡率。紫外輻射3 min，致死率達到90%；紫外輻射4 min，致死率達到99%以上。紫外輻射時間與致死率的關系見圖2。

圖2 紫外誘變致死率

2.4.2 菌株F6紫外誘變結果 在其他條件不變的情況下設定不同的時間梯度（1、2、3、4 min），其中1～3 min的誘變效果不理想，透明圈大小與酶活均不高，4 min的誘變效果較為突出。由表3可見，菌株4-2-2的濾紙酶活和CMC酶活最高，分別達到1827.372 U/mL和3171.598 U/mL；菌株4-2-3的 HC值（D/d）最大，但濾紙酶活和CMC酶活均不是最高；菌株4-2-7的CMC酶活與濾紙酶活比值最大，說明所產纖維素酶以內切酶為主要成分。

2.4.3 菌株4-2-2的鏡檢特征 通過光學顯微鏡觀察發現，菌株4-2-2的孢子絲較直，有隔膜，有二叉分枝。菌絲成熟后斷裂成單個或成鏈、長筒形、末端鈍圓的節孢子。

2.4.4 菌落透明圈的比較 原始菌株F6的菌落直徑及透明圈直徑均小于突變株，其中菌株4-2-2的透明圈為最大，HC值也為最大值。結合2.4.2及2.4.4的結果，說明經4 min的紫外誘變處理后，得到一株能高產濾紙酶和CMC酶的菌株4-2-2。

2.4.5 突變株與原始菌株產酶活性能的比較 由圖3可知，菌株4-2-2產濾紙酶和CMC酶的酶活均比出發菌株高很多，并且均在第4天酶活達到最高值。

2.4.6 變異株遺傳穩定性試驗 為了測定突變株產酶的穩定程度，將突變菌株4-2-2在PDA培養基上連續傳代，并在發酵培養基中培養，測定酶活，結果見表4。由表4可知，各重復值之間差異均不顯著，因此，該菌株具有較好的遺傳穩定性。

圖3 突變株與原始菌株發酵產酶活性比較

表4 傳代次數對酶活的影響U/mL

3 結論

人工誘變選育高酶活的纖維素酶產生菌及優化其產酶條件是降低纖維素酶生成本的重要方法（Thomas，1992）。 張海生等（2004）研究報道，以原始菌株里氏木霉M277為出發菌株，采取紫外誘變，經初篩、復篩獲得M277-7高產菌株。本研究從土樣中分離篩選出12株產纖維素酶能力較強的菌株，經搖瓶發酵復篩，獲得了產纖維素酶活較高且穩定的菌株F6。以該菌株為出發菌株用紫外燈（254 nm，30 W）對其進行物理誘變，并設置不同的誘變時間（1、2、3、4 min），獲得纖維素酶高產菌株4-2-2。通過DNS法測定菌株4-2-2的酶活，其CMC酶活達3171.598 U/mL，濾紙酶活達1827.372 U/mL，分別比出發菌株提高3.58倍和8.67倍。本試驗對菌種進行誘變時僅采用紫外線照射，對于利用復合誘變技術是否有更為理想的效果還有待于進一步研究。

[1]Mandels M.發酵法生產纖維素酶的某些問題和解決辦法[J].應用微生物，1976，6：53 ～ 62.

[2]錢存柔，黃儀秀.微生物學實驗教程[M].北京：北京大學出版社，1999.

[3]閆峰，徐鳳花，顧金剛，等.木霉屬真菌的生物降解及生物轉化作用研究進展[J].微生物學雜志，2009，29（3）：77 ～ 80.

[4] 葉姜瑜.一種纖維素分解鑒別培養基[J].微生物學通報，1997，24（4）：251～252.

[5]張海生，陳德兆，黃利利，等.紡織用纖維素酶高產菌種的選育、固態發酵及其應用[J].印染助劑，2004，21（3）：39 ～ 40.

[6]Thomas M.Wood，Fungal cellulases[J].Biochemistry Society Transaction，1992，20：46 ～ 53.