腦缺血大鼠腦組織中強啡肽A（1－8）含量及含水量的變化＊

西安交通大學醫學院第二附屬醫院（西安710004）

展淑琴△ An Zhou△ Tao Yang△ 郭新奎 黃 芳

強啡肽（DYN）是中樞神經系統廣泛分布于腦與脊髓中的一類重要的神經遞質，DYN對κ受體的選擇性較強，它是一種與應激有關的神經肽，有研究證實急性腦缺血不同時期腦、腦脊液和血液中內源性阿片肽濃度均發生明顯變化，表明內源性阿片肽在缺血性腦損傷的病理生理過程中發揮著重要作用。強啡肽A（1－8）［DYN－A（1－8）］是一種含8個氨基酸的短鏈多肽，我們既往的研究發現給腦缺血小鼠腦室內注射合成的 DYN－A （1－8）可明顯縮小腦梗死面積［1］，為觀察局灶性腦缺血大鼠腦皮層及紋狀體中DYN－A（1－8）含量的變化及局灶性腦缺血大鼠腦皮層及紋狀體含水量的變化，我們進行了此項研究，現報道如下。

材料和方法

1 動物及組織準備 用大腦中動脈阻塞（MCAO）的方法建立短暫性局灶性腦缺血模型［2］。雄性Sprague－Dawley大鼠（體重250～300g）48只，購自Charles River Laboratories，大鼠在含700ml/L 一氧化二氮、300ml/L氧的氣體中被40ml/L異氟烷麻醉，并以20ml/L異氟烷維持。MCAO組24只，通過引導一根3－0的絲線進入一側頸內動脈腔，同時結扎頸外動脈及頸內動脈顱外段制造大腦中動脈阻塞模型，絲線在100min后被撤出并使再灌注達24h，在再灌注結束時間點（8h及24h），每組各12只大鼠在麻醉狀態下被斷頭取腦，其中6只全腦立即在干冰上冷凍－80℃保存備用，另6只分離皮層及紋狀體后進行皮層及紋狀體含水量的測定。假手術對照組24只（8h及24h時間點各12只），麻醉、血管分離同上，但不行線拴及動脈結扎，余同MCAO組，其中6只全腦立即在干冰上冷凍，－80℃保存備用，另6只分離皮層及紋狀體后進行皮層及紋狀體含水量的測定。

2 腦組織處理 分離缺血側腦皮層及紋狀體組織，樣品稱重后勻漿處理，腦組織勻漿用含1mM EDTA及蛋白酶抑制劑的0.1MHCl緩沖液處理，100℃煮沸15min并立即在冰上冷卻后于4℃13000rpm離心20min，吸上清液入一套新管，用Bradford法（Sigma－Aldrich）測定所有樣本的蛋白濃度。

3 DYN－A（1－8）的放免測定 取含55μg蛋白的上清液行真空離心140min，真空抽干后的樣本用放免法測定DYN－A （1－8）含量（pmol/g brain tissue；mean±s）。放免試劑盒購自Peninsula Laboratories inc。

4 腦含水量的測定 將大鼠斷頭取腦，剔除低位腦干及小腦，分離左右半腦，用濾紙吸去腦表面的水分，分離缺血側皮層及紋狀體后取各缺血側皮層及紋狀體組織裝入稱量瓶，電子分析天平稱取各組各約120mg濕重的缺血側皮層或紋狀體組織 （精確到0.1mg），然后置于干燥箱內100℃烘24h至恒重后再稱干重，按下列公式計算腦含水量：腦含水量（%）＝（濕重－干重）/濕重×100%。

結 果

1 DYN－A（1－8）含量的變化 見表1。隨再灌注時間的延長，缺血腦皮層及紋狀體內DYN－A（1－8）的含量逐漸下降。

表1 腦缺血后再灌注8h及24h大鼠缺血側腦皮層及紋狀體內強啡肽A（1－8）含量的變化（pmol/g，±s）

表1 腦缺血后再灌注8h及24h大鼠缺血側腦皮層及紋狀體內強啡肽A（1－8）含量的變化（pmol/g，±s）

注：與假手術對照組在同一部位及同一時間點相比aP＜0.05，與再灌注8h大鼠在同一部位相比bP＜0.05

8h（n＝6）24h（n＝6）組 別皮層 紋狀體假手術對照組 5.58±0.61 7.72±0.92皮層 紋狀體5.43±0.52 7.59±0.88腦缺血組 3.51±0.43a 5.62±0.71a 2.41±0.32ab 4.35±0.63ab

2 腦皮層及紋狀體含水量的變化 見表2。缺血側再灌注8h及24h的腦皮層及紋狀體含水量均明顯增加，與假手術對照組相比有顯著性差異（P＜0.05），且再灌注24h的缺血側腦皮層及紋狀體含水量較再灌注8h增加，差異有顯著性（P＜0.05）。

表2 腦缺血后再灌注8h及24h大鼠缺血側腦皮層及紋狀體含水量的變化 （%）

討 論

內源性阿片肽包括內啡肽、DYN、腦啡肽、內嗎啡肽以及孤啡肽，它們存在于腦組織、腦脊液及血液中，是體內具有阿片樣活性的一組物質，在體內發揮神經遞質和激素的功能，對機體的心血管功能、內分泌免疫網絡的調節以及消化系統、鎮痛、呼吸系統等都有重要的調節作用。DYN包括DYN－A、DYN－B及α－新內啡肽。DYN－A是Goldstein等1979年從豬垂體中提取的一種阿片樣活性極強的17肽DYN，DYN－B是1982年Goldstein和Udenfriend分別發現的另一種13肽DYN，其N末端還經一對堿性氨基酸與上述17肽DYN的C末端相接，它們在腦和脊髓內有廣泛分布，其功能復雜多樣。它是一種與應激有關的神經肽，DYN對κ受體選擇性強，被認為是κ受體的內源性配體。近20多年來，對阿片肽的研究一直是神經科學領域研究的熱點問題之一，內源性阿片肽在中樞神經系統中的作用也取得了很大進展。其中作為內源性阿片肽的β－內啡肽、DYN和腦啡肽與中樞神經系統損傷有著密切的關系。近年來，多數學者認為β－內啡肽、DYN－A、亮氨酸腦啡肽參與了中樞神經系統的繼發性損傷［3］。腦啡肽參與了腦血管疾病的病理生理過程，引起一系列神經系統的癥狀。有研究證實急性腦缺血不同時期腦、腦脊液和血液中內源性阿片肽濃度均發生明顯變化，表明內源性阿片肽在缺血性腦損傷的病理生理過程中發揮著重要作用。DYN參與中樞神經系統損傷后的繼發延遲性病理損害過程，是阿片肽中作用最強的一種［4］。

本研究在假手術對照組大鼠及100min MCAO后再灌注8h缺血側腦皮層及紋狀體強啡肽A（1－8）的含量分別是5.58±0.61及3.51±0.43pmol/g，7.72±0.92及5.62±0.71pmol/g，假手術對照組大鼠及再灌注24h大鼠缺血側腦皮層及紋狀體強啡肽A（1－8）的含量分別是5.43±0.52及2.41±0.32pmol/g，7.59±0.88及4.35±0.63pmol/g，隨再灌注時間的延長，缺血側腦皮層及紋狀體中強啡肽A（1－8）的含量逐漸下降（P＜0.05）。

從本實驗結果看出短暫腦缺血后再灌注8h即出現缺血側腦皮層及紋狀體中DYN－A（1－8）含量的減少，且隨著再灌注時間的延長，DYN－A（1－8）的含量進一步減少。我們的研究還發現在100min MCAO后，隨再灌注時間的延長，缺血側腦皮層及紋狀體含水量增加，即隨再灌注時間的延長DYN－A（1－8）含量減少的同時伴有腦皮層及紋狀體水腫的加重。

DYN－A（1－8）由前蛋白轉化酶PC2發揮蛋白水解作用而來，既往我們的研究中發現小鼠腦室內注射合成的 DYN－A（1－8）可明顯縮小腦梗死面積［1］，提示DYN－A（1－8）在腦缺血時具有保護作用，具有治療腦梗死的潛力。Silvia等［5］也證明DYN－A能夠明顯改善貓腦缺血后的神經機能缺損程度，延長生存時間，減輕腦組織損傷。另有些研究也發現沙土鼠側腦室注射DYN－A后缺血大腦皮層Ca2＋含量大量降低，腦水腫明顯減輕［6］；超低濃度的 DYN－A（1－8）顯著阻止脂多糖引起的LDH釋放、神經元的缺失及細胞形態學的改變［7］；在單側腦缺血沙土鼠模型，DYN治療可明顯改善運動功能障礙［8］。

DYN－A （1－8）除與缺血性腦損傷關系密切外，還與癡呆、衰老、高血壓等有關。Sunderland等［9］發現阿爾茨海默病患者腦脊液DYN－A（1－8）水平較對照降低了40%，DYN－A（1－8）有延緩細胞衰老的作用。Berman等［10］發現限制食物可增加伏核、終紋床核、外側下丘腦的DYN－A（1－8）水平。海馬的DYN系統與孤立引起的高血壓的維持有關［11］，海馬內的 DYN－A（1－8）通過中樞機制降低動脈血壓。因此DYN－A（1－8）作用廣泛，與多種疾病密切相關。

Kao等［12］的研究認為DYN－A有對抗腦缺血時腦水腫的作用，能使缺血后腦重量減少到缺血前水平，多項研究表明DYN－A（1－8）在腦缺血時具有腦保護作用，因此我們認為DYN－A（1－8）含量的減少會加重腦水腫，影響腦缺血后腦神經細胞的存活，DYN－A（1－8）具有臨床治療腦梗死的潛力。

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