HPLC法測定人參養榮丸中人參皂苷Rb1的含量

麥艷珍,程 怡*,張素方，余秋強，趙菊香，鄧妙麗

(1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006；2.廣東醫學院，廣東 湛江 524000)

人參養榮湯出自《三因極一病證方論》，由人參、熟地黃、當歸、甘草、白術等14味中藥組方而成，具有益氣補血、健脾固腎、養心安神的功效。現代醫藥工作者根據湯劑處方改良生產工藝，制備成丸劑。《中國藥典》[1]2010版一部收載人參養榮丸,并對橙皮苷進行含量控制，制定質量標準。由于人參是本處方的君藥之一,其有效成分人參皂苷Rb1經現代藥理研究[2-3]表明對中樞神經系統、心血管系統、免疫系統以及在抗腫瘤方面都具有改善調節作用，因此本試驗建立對方中人參皂苷Rb1的HPLC含量測定方法,完善本制劑的質量標準。

1 儀器與試藥

戴安高效液相色譜儀(P680 HPLC Pump,ASI-100 Automated Sample Injector,PDA-100 Photodiode Array Detector,AT-330 Column Heater)，人參養榮丸為市售品(北京同仁堂股份有限公司，規格:9 g/丸)，人參養榮丸陰性樣品由本實驗室按處方組成及工藝制成缺紅參的樣品(中藥材均由康美藥業股份有限公司提供)，人參皂苷Rb1對照品(批號：110704-200318)，購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純；水為去離子水；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(30∶70)，流速：1.0 mL/min；柱溫35 ℃，檢測波長203 nm，進樣量10 μL；理論塔板數按人參皂苷Rb1計算不低于3 000。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rb1對照品3.50 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含人參皂苷Rb1 0.35 mg的人參皂苷Rb1溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品剪碎成小塊，精密稱定5.0 g，加入硅藻土1.5 g，研勻，置索氏提取器中，加甲醇60 mL，加熱回流提取至提取液近無色，提取液回收甲醇至干，殘渣加水30 mL，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL，棄去三氯甲烷液，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次30 mL，再用正丁醇飽和的水洗至中性，回收正丁醇至干，殘渣用甲醇溶解，轉移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，轉移至離心管，離心，過膜，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取缺人參的自制樣品，照2.3項下方法制成陰性樣品溶液。

2.5 專屬性試驗 按上述色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL進樣檢測，得色譜圖(見圖1)。結果表明處方中其他成分不干擾人參皂苷Rb1的測定。

圖1 人參養榮丸HPLC專屬性色譜圖

2.6 線性關系考察 在上述色譜條件下，依次精密吸取2. 1項下對照溶液2.0、6.0、10.0、14.0、18.0、22.0 μL，分別進樣。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積積分值(mAU×min)為縱坐標，繪制標準曲線，并計算線性回歸方程為Y=4.182 6X-1.208 8(r=0.999 5),結果表明人參皂苷Rb1在0.70～7.70 μg范圍內，其峰面積與進樣量有良好的線性關系。

2.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀測定峰面積，連續測定6次。測定峰面積，計算平均值為13.028，RSD=1.17%(n=6)，結果表明精密度良好。

2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液(批號0010012)，在24 h內分別每4h進樣1次，每次進樣10 μL，測定峰面積，計算平均值為14.242，RSD=0.92%(n=6)，結果表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.9 重復性試驗 取同一批號的樣品(批號0010012)，取樣6分，按2.3項下的方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，測定峰面積，計算平均值為14.238，RSD=2.13%(n=6)，結果表明該方法重現性良好。

2.10 回收率試驗 取同一批號(批號0010012)已知含量的樣品5 g，各6分，精密稱定，每分加1.5 g硅藻土，研勻，分別置索氏提取器中，精密加入甲醇60 mL，回流提取至無色，提取液回收甲醇至干，殘渣用水溶解，分別精密加入相當量的人參皂苷Rb1對照品，然后按2.3供試品溶液的制備項下自“用三氯甲烷振搖提取3次”起，繼續操作至供試品溶液制備完畢。進樣量為10 μL，在上述色譜條件下進樣分析，結果平均回收率為98.87%,RSD=0.86%(n=6)。結果表明該方法具有較好的準確度。

2.11 含量測定 制備3批樣品的供試品溶液，吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以外標法計算含量，結果0010012、0010061、0010256的人參皂苷Rb1含量分別為1.386、1.368、1.341。RSD分別為1.21%、0.98%、1.23%。

3 討論

本處方藥味較多，成分復雜。筆者曾采用不同的方法制備供試品溶液，結果HPLC色譜圖顯示對目標峰的干擾太大，分離效果不好。經查閱相關文獻[4-6]，進行多次反復試驗，證明人參皂苷Rb1在堿性條件下穩定，且樣品經堿性溶液洗滌后，能有效除去大部分酸性物質，排除HPLC檢測的干擾組分，故確定采用本試驗中的供試品溶液制備方法。

[1]中華人民共和國藥典委員會.中國藥典[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010:438-439.

[2]Shibata S.Chemistry and Cancer preventing activities of ginseng saponins and some related triterpenoid compounds[J].J Korean Med Sci,2001,16 (Suppl):S28-S37.

[3]楊艷平.人參皂苷Rb-1藥理作用的研究概述[J].中國藥師,2010,13(2):280-281.

[4]Zhao J,Wang D,Duan S,et al.Analysis of fuzhisan and quantitation of baicalin and ginsenoside Rb(1) by HPLC-DAD-ELSD[J].Arch Pharm Res,2009,32(7):989-996.

[5]宋磊,張春娜,郭圣榮,等.人參皂苷Rb-1在胃液和腸液pH下的穩定性考察[J].中國臨床藥學雜志,2004,3(4):211-213.

[6]南勁松,邱智東.雙參片中人參皂苷Rb1,Rg1,Re含量測定[J].吉林中醫藥,2008,28(9):679-680.