生肌玉紅明膠海綿生肌作用機理的實驗研究

高衛衛

(徐州醫學院附屬醫院 肛腸科，江蘇 徐州 221000)

生肌玉紅膏具有祛腐生肌之功效，臨床應用廣泛，實驗研究亦發現其具有促進創面微循環、血管新生、肉芽生長、膠原合成、上皮生長及調控局部成纖維細胞生長因子水平等作用。明膠海綿作為止血的體內植入藥物長期運用于臨床，安全性高，無毒副作用，其主要成分是膠原，經過修飾后可以提高組織相容性及促進血管生成。我們前期[1]對生肌玉紅膏載入修飾后明膠海綿發現其促進創面肉芽生長的機理之一是促進血管生成及改善創面微循環。本文將觀察生肌玉紅明膠海綿對創面愈合率、肉芽組織中bGFG陽性細胞數、Ⅰ、Ⅲ膠原含量、羥脯氨酸含量的影響，進一步探討其生肌作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 明膠海綿；生肌玉紅紗布；凡士林紗布；即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒；DAB顯色試劑；CollagenⅠ、CollagenⅢ；b-FGF試劑盒；羥脯氨酸測試盒；756PA紫外可見光光度計；光學顯微鏡等。

1.2 藥物來源及制劑加工 生肌玉紅明膠海綿的制備流程:以生肌玉紅膏主要藥物組成(當歸、紫草、血竭、白臘、白芷、甘草，去除輕粉 )20 g劑量均勻攪拌于肝素修飾后的明膠海綿膠原中，接著行低溫(-20 ℃)凍干形成生肌玉紅明膠海綿。

生肌玉紅明膠海綿消毒：制作好的生肌玉紅明膠海綿裝玻璃器皿密封后，予鈷60-γ射線輻照，每周消毒1次，輻照標準參照1997年衛生部發布《60Co中藥滅菌標準》(江蘇省農業科學院原子能研究所提供)。

1.3 動物分組及給藥 實驗動物及造模方法：選取SD大鼠40只(200～250 g)雌雄各半，參照付小兵全層皮膚缺損法制成動物體表潰瘍模型。實驗分組及給藥方法:將大鼠隨機分為4組:凡士林對照組(F組)10只、生肌玉紅膏組(S組)10只、修飾后明膠海綿組(M組)10只、生肌玉紅明膠海綿組(SM組)10只。創傷模型制成后，醫用碘伏消毒創面,在F組大鼠的創面上敷凡士林紗條并用無菌敷料包扎創面；S組大鼠的創面上敷生肌玉紅膏后再予無菌敷料包扎創面；M組大鼠的創面上敷明膠海綿后再用無菌敷料包扎創面；SM組大鼠的創面上敷生肌玉紅明膠海綿后再予無菌敷料包扎創面。每組均為隔日換藥1次。

1.4 觀察指標與檢測方法

1.4.1 大體指標 創面愈合率:造模后第3、7、14天用數碼相機對創面照相，拍攝時鏡面與創面保持平行，鏡面距創面約15 cm,并在創面邊緣放一刻度尺，拍照后將照片存入電腦，記錄拍照日期及分組情況，用Image J軟件利用測定像素比例測出創面面積。

1.4.2 病理指標 Ⅰ、Ⅲ膠原含量、bFGF陽性細胞數:取造模后第3、7、14天創面中心肉芽組織，石蠟固定后，與創面肉芽平行方向切片,行HE染色后，采用MaxVisionTM即用型快速免疫組化一步法測定。

Ⅰ、Ⅲ膠原以有棕黃色染者為陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照，染色結果應用Image2 Pro Plus 4.1版本計算機圖像分析系統在顯微鏡下計算區域的陽性面積百分比(%)，求出5個視野平均值，實驗結果以細胞及基質顯色面積為標準。

bFGF免疫組化標記定位于細胞漿，以細胞漿著色呈棕黃色為陽性細胞。目鏡為10倍，物鏡為20倍的條件下，采用雙盲法，由2個觀察者對各組標本每個切片隨機選取5個視野，計數陽性細胞數及總細胞數，并計算陽性細胞率。

1.4.3 生化指標 羥脯氨酸含量:采用樣本堿水解法，將創面肉芽取出稱重后，予以勻漿后離心，加入試劑后，以分光光度儀測定其吸收值。

2 結果

2.1 各組創面愈合率比較 見表1。

表1 各組創面不同時間愈合率(±s) %

2.2 bFGF免疫組化標記結果 見圖1，圖2。

注:柱狀圖形為各組創面肉芽內bFGF陽性細胞百分比的均數，誤差線為各組標準差(下同)。與凡士林組比較，#P<0.05或0.01；與生肌玉紅膏組比較，△P<0.05或0.01。

圖2 大鼠肉芽第7天bFGF免疫組化照片(×200倍)

2.3 大鼠創面肉芽中Ⅰ型膠原結果 見圖3，圖4。

注：與凡士林組比較，#P<0.05或0.01;與生肌玉紅膏組比較，△P<0.05或0.01。

圖4 大鼠肉芽第7天Ⅰ型膠原免疫組化照片(×200倍)

2.4 創面肉芽中Ⅲ型膠原含量 見圖5，圖6。

注:與凡士林組比較，#P<0.05或0.01；與生肌玉紅膏組比較，△P<0.05或0.01。

圖6 大鼠肉芽第14天Ⅲ型膠原免疫組化照片(×100倍)

2.5 各組創面肉芽內羥脯氨酸含量 見表2。

表2 各組創面肉芽組織中羥脯氨酸含量(±s) μg/mg

3 討論

膠原，尤其是Ⅰ型膠原，是生物體各種結締組織的主要組成，具有促進組織愈合、可體內降解且降解碎片具有組織相容性的特性，同時經過修飾后可以提高組織相容性及促進血管生成，已成為組織工程中應用最廣的生物材料[2]。明膠是膠原經溫和斷裂后的產物，它與膠原具有相同的化學組成，保留了膠原大部分的優良理化性能。

通過將生肌玉紅膏載入修飾后明膠海綿，明膠海綿中的肝素隨著明膠的降解進入創面，與組織中的促血管生成生長因子發生生理性結合，提高其促血管生成的療效[3]，新生的血管為纖維的包裹提供了良好的支架，同時為肉芽的生長提供了良好的血運。造模后第3、7天，各組bFGF含量均呈逐漸上升的趨勢，實驗組bFGF陽性細胞數顯著高于控制組，而生肌玉紅明膠海綿組顯著高于生肌玉紅膏組及明膠海綿組。內源性bFGF表達增加，不僅可通過趨化作用使單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等向損傷部位聚集，減輕炎癥反應，同時能促進血管和肉芽組織的生成，促進軟組織和骨組織中各種與損傷修復重建有關的細胞分裂增殖[4]。因此在創傷修復炎癥期及增殖期，經肝素修飾后的明膠海綿能刺激血管生成，加速肉芽的生長，其療效和生肌玉紅膏相似，生肌玉紅明膠海綿的療效又好于二者。造模后第14天，各組bFGF含量下降，且生肌玉紅明膠海綿組及生肌玉紅膏組顯著低于對照組。既往研究[1，5]結果顯示：生肌玉紅明膠海綿在創傷初期肉芽內VEGF含量升高，而后期VEGF含量稍下降；生肌玉紅膏能在創傷修復各期調節局部組織中成纖維細胞生長因子，均與本次實驗結果一致。

在創面愈合過程中，Ⅰ、Ⅲ型膠原起著重要作用[6]。Ⅲ型膠原比例高低與瘢痕的形成及質量好壞密切相關。創傷形成后，纖維細胞增生，促進纖維形成，以填補組織缺損，因此造模后第3、7天，實驗各組Ⅰ、Ⅲ型膠原均顯著增生，Ⅰ型膠原以生肌玉紅明膠海綿增生顯著，高于其他2個實驗組；而Ⅲ型膠原作為新生膠原，增生活躍，故各組第3天無統計學差異，而第7天各實驗組與控制組達到顯著差異。在創傷修復塑性期,生肌玉紅明膠海綿組Ⅰ型膠原稍下降，而Ⅲ型膠原含量仍維持較高水平，這對于降低Ⅰ、Ⅲ膠原比例，減少瘢痕的形成，提高創傷修復質量有重要意義。

羥脯氨酸(OHP)多見于膠原內,是膠原蛋白的主要而恒定的成分，一般以羥脯氨酸含量的7.46倍代表膠原的量[7]，因此，通過測定OHP的含量可間接反應膠原的含量,了解創面愈合過程中膠原代謝狀況。造模后，各組創面肉芽中羥脯氨酸含量逐漸升高，至第14天達到峰值，且生肌玉紅明膠海綿組羥脯氨酸含量在各期均顯著高于控制組，第14天時與生肌玉紅膏組達到顯著性差異，說明生肌玉紅明膠海綿在促進膠原合成方面優于生肌玉紅膏，能快速填補組織缺損，提高愈合率。

總之，通過本實驗，我們認為，生肌玉紅明膠海綿生肌作用的機理主要是通過bFGF介導的。膠原的更新過程主要依賴膠原酶的作用，膠原酶主要是成纖維細胞產生，而bFGF正是成纖維細胞的趨向劑和有力的生長刺激劑。創傷初期，生肌玉紅明膠海綿通過提高創面內源性bFGF含量，促進血管新生，趨化炎性細胞減輕炎癥反應，刺激成纖維細胞增生、合成纖維和基質，增生的毛細血管、纖維和基質共同形成肉芽組織，填充缺損，有利于周圍上皮組織的爬行，促進創面愈合。在創面塑性期，通過下調bFGF水平，促進過度增生膠原降解，使其排列有序，減少瘢痕形成。而生肌玉紅明膠海綿的多孔特性，使其具有良好的親水性，敷于創面后吸濕性好，及時排出創面滲出，也為肉芽的生長提供了良好的環境。

[1]姚昶,孫海艦,姚涌暉,等.生肌玉紅明膠海綿促進機械性創面肉芽生長的實驗研究[J].醫學研究雜志,2009,38(5):62-65.

[2]HUTMACHER D L,HURZELER M B.A tissue engineered cell-occlusive device for hard tissue regeneration--a preliminary report[J].The International Journal of Periodontics & Restorative Dentistry,2001,21:49-59.

[3]YAO C,NOAH E M,STEFFENS G M,et al.The effect of crosslinking of collagen matrices on their angiogenic capability[J].Biomaterials,2008(29):66-74.

[4]CHUA K-h,AMINUDDIN B S,FUZINA N H,et al.Basic fibroblast growth factor with human serum supplementation:enhancement of human chondrocyte proliferation and promotion of cartilage regeneration[J].Singapore Medical Journal,2007,48(4):324-332.

[5]姚昶,潘立群.生肌玉紅膏對創面堿性成纖維生長因子含量影響的實驗研究[J].江蘇中醫,1999,20(8):42.

[6]VISHWANATH M,MA Lisha,OTEY C A,et al.Modulation of corneal fibroblast contractility within fibrillar collagen matrices[J].Investigative Ophthalmology & Visual Science,2003,44(11):4724-4735.

[7]李震,李祝,房秋寒,等.中藥抗皮膚衰老劑對小鼠皮膚羥脯氨酸含量的影響[J].山東中醫藥大學學報,1997,21(2):142-143.