稀薟上雙生病毒的分子鑒定技術研究

董志輝

(遼寧省沈陽市蘇家屯區中醫醫院，遼寧沈陽220101)

1 引言

粉虱傳雙生病毒(Whitefly transmitted geminivirus，WTG)是一類廣泛發生在熱帶、亞熱帶地區植物上的具有孿生顆粒形態的單鏈DNA病毒。在分類上屬雙生病毒科(Geminiviridae)的菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)。該屬的大多數病毒是雙組份雙生病毒，其基因組為兩條長度相似(每條約2.8kb)的閉合環狀ssDNA分子，分別為DNA－A和DNA－B。少數病毒為單組分雙生病毒，僅有一個DNA－A組分［1］。目前，在亞洲和非洲等許多國家的單組份begomoviruses上發現了伴隨有DNAβ的病害復合體。DNAβ對于begomoviruses誘導典型癥狀是必需的，并可能在決定病毒寄主范圍中起重要作用，為病毒適應更多的寄主提供了機會［2～5］。我國自 1982 年報道［6］發現雙生病毒以來，在云南、海南、廣西、和廣東等18省區的番茄、番木瓜、煙草和番薯等已相繼發現多種雙生病毒［7～11］。雙生病毒在我國的危害日益嚴重，隨著全球氣候變暖、農業生態環境變化、煙粉虱賴以越冬的地域不斷北移以及交通、旅游、農產品貿易全球化等因素，我國雙生病毒發生地區不斷北移，并給生產上造成較大的損失［12］。本文對從福建漳州稀薟(Siegesbeckia orientalis)上采集到具典型雙生病毒癥狀的樣品進行了分子檢測，并對序列進行了分析。

2 實驗方法

2.1 植物樣品

2012年2月，在福建漳州地區采集到表現雙生病毒的典型黃脈癥狀稀薟樣品。

2.2 DNA提取及PCR擴增

利用CTAB法提取的稀薟病樣總DNA作為模板［13］。利用引物 PA/PB［11］(TAATATTACCKGWKGVCCSC/TGGACYTTRCAWGGBCCGCACA)擴增雙生病毒基因組DNA－A的部分序列，根據測出的序列設計引物FJ12F/R(ACAGAATGTACAAAAGCCCTGA/ATCTGCTGGTCGCTTC GACAT)擴增近全長的DNA－A，擴增的PCR產物克隆至pMD－18T Vector，測序。利用通用引物PCRC1/PBL1V 2040［14］(CTAGCTGCAGCATATTTACRARWATGCC/ACCTCTGCAGCARTGRTCCKATYTTCATAC)擴增雙生病毒DNA－B組分。利用通用引物Beta01/02(GTAGGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC/AGTGGTACCTACCCTCCC AGGGGTACAC)［15］擴增雙生病毒伴隨衛星DNAβ分子。利用通用引物DNA101/102(GTAGGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC/AGTGGTACCTACCCTCCCAGGGGTAC AC)［16］擴增雙生病毒伴隨衛星DNA1分子。

2.3 序列分析

序列測定由上海生物工程有限公司完成。數據處理借助 DNAStar軟件(DNASTAR Inc.，Madison，USA)和 DNAMAN Version 6.0(Lynnon Biosoft，Quebe Canad)進行。利用BLAST程序在GeneBank數據庫中尋找與DNA－A和DNAβ序列最相近的基因組序列。采用DNAStar分析軟件(Madison，Wis.，U.S.A)中 ClustalV方法對DNA－A和DNAβ序列的核苷酸或者氨基酸的相似性進行分析。采用Mega4.0臨近法繪制親緣關系樹，設置種子重復數是1000［17］。

3 實驗結果與分析

3.1 病毒基因組DNA－A的分子特征

FJ12 DNA－A全長2770nts，具有典型的雙生病毒基因組結構，即編碼6個開放讀碼框架(ORFs)，其中病毒鏈編碼AV1(CP)和AV2兩個ORFs，互補鏈編碼AC1(Rep)、AC2、AC3和 AC4共4個 ORFs。DNA －A 還含有一個較長的非編碼區，又稱基因間隔區(Intergenic Region，IR)，并含有保守序列TAATATTAC及TATA盒(核苷酸2672－2675位)，還有重復序列GGTGTC(核苷酸2625－2631位，重復于核苷酸2654－2659位和2661－2666位，反方向重復于核苷酸2654－2659位2680－2685)，該重復序列是復制酶蛋白的結合位點。

從全基因組看，相似性與稀薟黃脈病毒的同源性最高，為95.7%，其次與中國番木瓜曲葉病毒PaLCuCNV的相似性較高，為76.8%。而FJ12 IR除了與稀薟黃脈病毒的同源性最高為86.8%外，與其它begomoviruses的相似性都很低，只有39.9% ～58.6%。對編碼的蛋白序列進行比較時，FJ12編碼的6個基因都與SbYVV的同源性最高，其中 AV1為96.6%，AV2為95.3%，AC1為97.3%，AC2 為 91.2%，AC3 為 94.0%;AC4 為93.8%(表1)。

表1 FJ12DNA－A與其他雙生病毒DNA－A核苷酸和氨基酸序列的相似性比較 %

病毒DNA-A IR AV1 AV2 AC1 AC2 AC3 AC4 TbCSV 72.2 58.6 80.9 62.6 85.0 56.0 69.4 77.3 TbLCJV 70.0 44.8 76.5 66.4 80.6 59.3 71.6 73.2 ToLCGdV 76.2 50.5 95.3 76.7 84.2 60.0 69.4 74.2 ToLCVV 75.9 55.8 95.3 73.3 84.5 56.3 61.2 76.3 TYLCCNV 72.8 54.9 80.1 68.7 83.9 57.5 74.6 78.4 SbYVV 95.7 86.8 97.3 96.6 95.3 91.2 94.0 93.8

為了進一步明確這FJ12分離物與其它病毒的系統親緣關系，筆者構建了基于DNA－A核苷酸序列的系統關系樹(圖1A)。從圖上可看出，與序列比較的結果相似，FJ12在系統樹上與SbYVV聚類在一起，稀薟黃脈病毒進化關系相對其它begomoviruses較近。

根據雙生病毒科分類標準，即病毒全基因組核苷酸序列同源性小于89%，往往定名為不同病毒，大于89%，則認為是同一病毒的不同株系［1］。以上分析結果表明:FJ12 DNA－A是稀薟黃脈病毒在福建的一個新的分離物。

3.2 衛星DNAβ分子的分子特征

利用特異性引物beta01/beta02擴增到約1300 bp的片段，經測序后發現是DNAβ分子(FJ12β)。FJ12β全長為1331 nts，具有典型的伴隨衛星分子的基因組結構:含有一個保守的ORF，是編碼116個氨基酸的βCl基因;含有一個保守的SCR區，并在SCR的3’端具有九核苷酸TAATATT/AC;一個富含腺嘌呤A的區域(A－rich region)，序列的位置在717～979nts，其中A含量達到51.0～52.5%，A的重復數最高為7個。

序列比較分析結果顯示，FJ12β與已知的衛星分子的同源性都很低，只有30.6% ～70.2%。其中，FJ12β與 SbYVV DNAβ相似性最高，為70.2%。βCl相似性也與SbYVV DNAβ最高，為92.2%，其余都在25.0% ～44.8%之間。SCR是 DNAβ 分子中最保守的區域，其相似性為74.8% ～97.0%，其中與SbYVV DNAβ最高，為97.0%。這說明稀薟樣品中的DNAβ分子確實可以用保守的SCR區作為探針檢測到，但它是一類全新的DNAβ分子，伴隨于稀薟樣品中發現的DNA－A(表2)。

表2 FJ12β與其他DNAβ的全長核苷酸及βC1編碼的氨基酸序列相似性比較 %

為了進一步明確這FJ12β與其它衛星分子的系統親緣關系，構建了基于DNAβ核苷酸序列的系統關系樹(圖B)。從圖上可看出，與序列比較的結果相似，FJ12在系統樹上與SbYVV聚類在一起成一個小分支，與稀薟黃脈病毒進化關系相對其它begomoviruses較近。

圖1 FJ12DNA－A和其他雙生病毒全長核苷酸序列構建的系統關系樹(A)FJ12β和其他雙生病毒DNAβ全長核苷酸序列構建的系統關系樹(B)

根據雙生病毒科衛星分子分類標準，即病毒衛星分子全基因組核苷酸序列同源性小于78%，往往定名為不同病毒，大于78%，則認為是同一病毒衛星的不同株系［18］。以上分析結果表明，FJ12 DNAβ是雙生病毒伴隨衛星的一個新種，建議命名為福建稀薟黃脈病毒伴隨衛星分子。

4 結語

(1)FJ12稀薟樣品都由雙生病毒侵染，該病毒是單組份雙生病毒，基因組由一個DNA－A組分(FJ12DNA－A及其伴隨衛星DNAβ分子(FJ12DNAβ)組成。不含有 DNA－B和 DNA－1組分;

(2)FJ12 DNA－A全基因組的核苷酸序列與稀薟黃脈病毒的同源性最高，為95.7%。根據雙生病毒分類標準，說明FJ12稀薟樣品上的雙生病毒為稀薟黃脈病毒在福建的一個新的分離物。

(3)FJ12DNAβ分子全基因組的核苷酸序列與稀薟黃脈病毒伴隨衛星的同源性最高，為70.2%。根據雙生病毒伴隨衛星的分類標準，說明FJ12DNAβ是一個新型的衛星分子，我們推薦將其命名為福建稀稀薟黃脈病毒伴隨衛星分子。

(4)進化樹分析顯示，FJ12 DNA－A和FJ12DNAβ都與稀薟黃脈病毒的親緣關系最近，推測DNA－A在進化過程中捕獲了其他植物或病毒的分子后，重組得到新的DNAβ分子。

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