大鼠腦組織中甲狀腺素受體THRα1的表達與阿爾茨海默病的發病機制

頡賓芳孫雯雯劉卉王佳冰劉昕

·論 著·

大鼠腦組織中甲狀腺素受體THRα1的表達與阿爾茨海默病的發病機制

頡賓芳*孫雯雯*劉卉△王佳冰*劉昕*

目的觀察大鼠大腦皮層和海馬區腦組織中甲狀腺素受體THRα1的表達與阿爾茨海默病發生的相關性并對其機制進行初步探討。方法SD大鼠腹腔注射D-半乳糖50 mg·（kg·d）－1，復制阿爾茨海默病動物模型，另設正常對照組，腹腔注射等量生理鹽水。連續給藥6周后觀察動物精神狀態、活動情況等；取大腦皮層和海馬區組織制作病理切片，光鏡下觀察其形態學變化；分別用實時熒光定量PCR（FQ-PCR）法和Westernblot法檢測阿爾茨海默病動物與正常大鼠腦組織中THRα1、CDK-5及p35 mRNA的差異性表達和pser404-tau蛋白的表達水平。結果與正常對照組相比，阿爾茨海默病模型組動物神情呆滯，反應遲鈍，鏡下見大腦皮層及海馬區神經元排列紊亂，核濃染、固縮，神經元軸突染色較深呈拖尾狀，形成神經元纖維纏結，尤以海馬區表現更為顯著。與對照組相比，模型組皮層區THRα1、CDK-51和p35 mRNA表達量增加，分別為 （1.20±0.30）、（4.71±0.54）、（2.11±0.40），差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組海馬區三者的表達量分別為（2.53±0.65）、（18.51±2.7）、（5.96±0.49），與對照組相比亦有統計學差異（P＜0.05）。模型組pser404-tau蛋白呈高表達狀態，與正常對照組相比P＜0.05。結論大腦皮層及海馬區腦組織中THRα1 mRNA的過表達及由此而加劇的神經細胞tau蛋白磷酸化可能參與或促進了大鼠阿爾茨海默病的發生發展。

甲狀腺素受體α1 阿爾茨海默病 Tau蛋白磷酸化 細胞周期素依賴性蛋白激酶5

阿爾茨海默病（（Alzheimer disease，AD）是老年人最常見的神經系統退行性疾病，發病機制迄今尚未闡明［1－3］。THRα1是腦組織中表達最多的甲狀腺素受體（thyroid hormone receptor，THR）［4－5］。當甲狀腺素與之結合后，通過甲狀腺素反應元件（thyroid hormone response elements，TRE）調控靶基因的表達［4］，而與腦組織tau蛋白磷酸化水平密切相關的細胞周期素依賴性蛋白激酶5（cyclin-dependent kinase5，CDK-5）即其靶基因之一。近年有關甲狀腺激素水平與AD認知功能損害間關系的研究已有部分報道［6－8］；但THRα1及CDK-5在腦組織中表達水平的變化是否與AD發生有關尚未見相關報道。本實驗擬就此作初步研究。

1 材料

1.1 動物雄性健康SD大鼠40只，體重180～220 g，由湖南斯萊克有限公司實驗動物中心提供（動物許可證號：HNASLKG20100293）。大鼠隨機分籠飼養，自由攝食與飲水，室溫20～22℃，維持每日光照12 h。標準鼠飼料由蘭州大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 AD動物模型的復制 依隨機數字表法將大鼠分為AD模型組和正常對照組，每組20只。AD模型組腹腔注射D-半乳糖溶液50 mg·（kg·d）－1［9］，正常對照組注射等體積生理鹽水，連續6周，每周稱重1次，依據末次稱重的克數調整給藥劑量。期間觀察動物一般狀況，如精神、活動、毛發、飲食等。

1.2.2 腦組織取材及病理切片制作 實驗6周之后，水合氯醛麻醉大鼠，迅速開胸暴露心臟，經左心室灌注4℃生理鹽水100 mL快速沖洗，再以預冷的4%中性多聚甲醛灌注，后迅速斷頭取出大腦皮層及海馬組織，隨機自每組中各取8只制成病理切片，進行HE染色10和改良Bicschowsky染色11，用以觀察腦組織中老年斑、神經原纖維纏結及神經元數量、體積、排列狀況等形態學變化。剩余組織冷凍于－80℃，用以檢測THRa1、CDK-5和p35 mRNA的表達及pser404-tau蛋白的表達。

1.2.3 大腦皮層及海馬組織中THRa1、CDK-5和p35 mRNA表達的檢測

1.2.3.1 RNA的提取及cDNA的合成 取皮層及海馬部位腦組織各100 mg，按照Trizol Reagent說明書提取總RNA，采用紫外分光光度法對其定量。按M-MuLV First Stand CDNA合成試劑盒說明取2 μL（8 μg）總RNA作為模板，反轉錄為cDNA，－20℃保存。

1.2.3.2 RT-PCR Primer6軟件設計各引物序列，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。THRa1：上游5′-CGGAATCAGTGCCAGTTGTGC-3′，下游5′-AGGAGTGGGCTCTGGTCGTTG-3′，擴增片段長度177 bp；CDK-5：上游5′-AGCCTTTGGTATCCCAGTCC-3′，下游5′-CAGTCGGTGTCCCT AGCAGT-3′，擴增片段長度224 bp；p35：上游5′-GAAGCGGCACTCCATCATCT-3′，下游5′-GGACA GGTTGGCACACGACAG-3′，擴增片段長度166 bp。設β-actin為內參照。2%瓊脂糖電泳觀察PCR結果。

1.2.3.3 SYBR Green FQ-PCR 按試劑盒說明設置反應參數，檢測各目的基因mRNA表達量，每樣本設3個平行，溶解曲線程序：94℃10 s，60℃30 s，從67℃～99℃自動繪制溶解曲線圖。實驗重復3遍。

1.2.4 pser404-tau蛋白表達檢測 取海馬組織100 mg，采用Western-blot法進行檢測，依次加入一抗和辣根過氧化物酶標記的IgG二抗，最后以ECL超敏發光液顯影成像分析。pser404-tau蛋白表達水平用目的蛋白條帶分別與內參照β-actin條帶灰度值之比標示，采用Image-Proplus軟件分析。

1.3 統計學方法采用SPSS 17.0進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，兩兩組間比較用t檢驗，檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 一般情況在清醒狀態下，正常對照組大鼠精神飽滿，反應敏捷，皮毛光潔；而模型組動物隨著造模時間的延長，逐漸出現精神差，神情呆滯，反應遲鈍，活動減少，被毛無光澤，晦暗不順，食欲減退等。

2.2 腦組織形態學變化

2.2.1 HE染色 正常對照組神經元排列規則整齊，形態完整；細胞核大而圓，著色較淺，位于細胞中央。膠質細胞的形態亦正常。AD模型組皮質及海馬區神經元細胞數目減少，細胞排列松散、紊亂，在變性壞死神經元周圍出現散在的粉紅色斑塊樣淀粉樣蛋白（圖1）。

2.2.2 改良Bicschowsky染色法 正常對照組海馬結構和神經元形態正常，細胞體未著色，軸突呈棕褐色，神經元纖維排列規則整齊、緊密、形態完整。AD模型組皮層及海馬區神經元排列散亂，細胞內神經原纖維增粗，可見較多胞體和軸突染色較深的神經元成拖尾狀，形成NFT（圖2）。

2.3 THRα1、CDK-5和p35 mRNA的表達瓊脂糖凝膠電泳示各基因擴增條帶單一、無雜帶，大小與預計相符，THRα1、CDK-5、p35、β-actin分別為177、224、166、200 bp（圖3）；SYBR Green FQ-PCR擴增曲線平滑，各基因均有明顯的指數擴增期（圖4）。設正常對照組各基因mRNA表達量為1，模型組皮層區THRα1、CDK-5、p35 mRNA表達量分別為正常對照組的 （1.20±0.30）、（4.71±0.54）、（2.11±0.40），與正常對照組相比，有統計學差異（*P＜0.05）；模型組海馬區THRα1、CDK-5、p35 mRNA表達量分別為正常對照組的 （2.53±0.65）、（18.51±2.77）、（5.96±0.49），與模型組皮層區比較，有統計學差異（**P＜0.05）（圖5）。

2.4 Western-blot檢測pser404-tau表達設正常對照組pser404-tau表達為1，與正常對照組相比較，模型組海馬區tau蛋白磷酸化位點絲氨酸404磷酸化水平增加至（1.20±0.05），有統計學意義（P＜0.05）（圖6，圖7）。

3 討論

阿爾茨海默病的主要表現是認知與記憶功能逐漸惡化及繼之而來的各種精神癥狀和行為障礙，海馬作為大腦學習記憶的關鍵部位是AD最早和最易受損的部位。AD的特征性病理變化：一是出現以β-淀粉樣蛋白為主體的老年斑（SP）；二是大腦皮質及海馬神經元出現大量神經原纖維纏結（NFT），主要成分是高度磷酸化的tau蛋白；三是海馬錐體細胞顆粒空泡變性和膽堿能神經損傷、神經元缺失等［12－13］，目前的研究多關注于各種原因引起的腦組織中SP形成在AD發生發展中的作用，而細胞內tau蛋白的過度磷酸化導致的NFT亦是AD發生的最重要變化之一。本實驗采用腹腔注射D-半乳糖法復制AD動物模型，顯微鏡下觀察皮層及海馬區神經元病理形態學變化，除見到細胞排列散亂，數量減少，細胞核固縮濃染及在變性壞死神經元周圍有散在的粉紅色斑塊樣淀粉樣蛋白即SP形成等變化之外，實驗還觀察到在皮層和海馬區腦組織中有神經元纖維增粗、排列紊亂呈拖尾狀等變化，即有NFT的形成。

圖1 腦組織形態學變化（HE，400×）A：正常組皮層區；B：模型組皮層區；C：正常組海馬區；D：模型組海馬區（箭頭所示：皮層及海馬區神經元排列散在、紊亂，神經元數目減少，可見大面積的核固縮、核濃染）

圖2 腦組織形態學變化（銀染，400×）A：正常組皮層區；B：模型組皮層區；C：正常組海馬區；D：模型組海馬區 （箭頭所示：皮層及海馬區神經元細胞內神經元纖維增粗、排列紊亂成拖尾狀，形成NFT）

圖3 RT-PCR示TRα1、CDK-5、p35、β-actin擴增產物

圖4 SYBR Green實時熒光定量PCR擴增曲線

圖5 各基因mRNA相對表達量①P35；②CDK-5；③THRα1注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.05

圖6 Western-blot X-光照片①正常對照組；②：模型組

圖7 Western blot檢測各組大鼠海馬區 Pser404-tau表達水平（P＜0.05 vs正常組）

THRα有THRal及THRa2兩類異構體，后者為甲狀腺素的非功能受體［14－15］。腦內THRα1占全部受體的70～80%，是甲狀腺素的主要功能型受體，參與細胞遷移、髓鞘形成、神經元分化等［16］。本實驗觀察到AD動物大腦皮層及海馬區域THRal表達顯著高于正常對照組大鼠。同時檢測到CDK-5亦呈高表達狀態。已證明在CDK-5啟動子區分子結構中存在甲狀腺素反應元件。甲狀腺素-受體二聚體可與之特異性結合影響其下游基因轉錄。CDK-5是tau蛋白磷酸化的關鍵激酶，參與了分裂后神經元的靶蛋白磷酸化［17－19］。CDK-5激酶活性依賴于特定的調節亞基p35。故實驗尚對比了AD模型組與正常組大鼠大腦皮層和海馬中p35 mRNA 及pser404-tau蛋白的表達。結果顯示，AD模型組大鼠的海馬及皮層區 THRα1、CDK-5和 p35 mRNA，pser404-tau蛋白表達水平較正常對照組均有顯著提高，尤其是海馬區。因而，根據實驗結果是否可以推測，由于THRα1的異常表達，通過CDK-5分子結構中的TRE，促進了CDK-5 mRNA的表達，在調節亞基p35的調節下CDK-5激酶活性大大增強，促進了的tau蛋白過度磷酸化，神經細胞內異常聚集形成神經原纖維纏結，導致微管穩定性降低，破壞、解聚，造成神經元的功能紊亂和退行性變，最終引起癡呆的發生。

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An experimental study on the expression of THRα1 in brain tissues in a rat model of Alzheimer’s disease.

XIE Binfang，SUN Wenwen，LIU Hui，WANG Jiabing，LIU Xin.Deparentment of Pathology and Pathophysiology，Basic Medical Science of Lanzhou University，LanZhou 730000，China.Tel：0931－8915023.

ObjectiveTo study the role of thyroid receptor α1（THRα1）in brain tissues in Alzheimer’s disease （AD）.MethodsD-galactose 50 mg·（kg·d）－1was administered by intraperitoneal injection into SD rats to create AD model.Control animals received intraperitoneal injection of the same amount of saline.The mental status and activities were then evaluated six weeks after treatment.Histological analysis was used to examine the morphological changes in the cerebral cortex and hippocampus.Real-time fluorescence quantitative PCR and Western-blot were used to detect the mRNA expression of THRα1，CDK-5 and p35 and protein expression of pser404-tau，respectively.ResultsCompared with control group，AD rats looked sluggish and were unresponsive.In the brain，particularly the hippocampus of AD rats，the neuronal arrangements were disorganized，nuclei were shrunk，and neuronal axons were deeply stained in a tail-like shape， forming neurofibrillary tangles.In AD rats， the mRNA expression levels of THRα1，CDK-5 and p35 were higher in the cortex and hippocampus.In addition，the expression level of pser404-tau protein was significantly higher in AD rats than in control rats（P＜0.05）.ConclusionsThe high level of THR α1 mRNA expression and phosphorylation of protein tau in neurons of the cortex and hippocampus may contribute to the pathological process of AD in rats.

Thyroid hormone receptorα1 Alzheimer's disease Tau phosphorylation CDK-5

R749.1

A

2011－10－31）

（責任編輯：李立）

10.3969／j.issn.1002－0152.2012.09.005

* 蘭州大學基礎醫學院病理生理學研究所（蘭州 730000）△甘肅省中醫學院附屬醫院