乳酸菌食品級表達系統的研究進展

蘇松坤， 晏勵民， 劉 芳

（浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058）

乳酸菌包括大量革蘭氏陽性球菌和桿菌，在發酵食品的生產和保存中廣泛應用。由于乳酸菌是安全級食品，所以大量的菌在基因水平上都進行了修飾，并且通過克隆技術介入特定的基因來改善乳酸菌本身的性狀，但是，傳統乳酸菌表達外源蛋白的效率仍然比較低。同時，目前報道的乳酸菌表達載體系統所使用的選擇標記均是抗生素抗性基因，而抗藥性基因將不斷向環境中漂移擴散，這對生物安全性造成了嚴重危害[1]。鑒于傳統乳酸菌基因表達系統的上述弊端，國內外學者一直致力于獲取高效且對人和動物無毒副作用的表達系統，也就是所謂的食品級表達系統。早在1987年，Willem就提出了乳酸菌的選擇標記必須采用食品級這一觀點[2]，之后，乳酸菌食品級表達系統作為高效而安全的表達系統得到了廣泛的應用。作者就乳酸菌食品級表達系統在食品、醫學、保健品上的應用的最新進展進行了綜述。

1 乳酸菌食品級基因表達系統必須具備的基本條件

1.1 表達載體必須是食品級

乳酸菌食品級表達系統所使用的載體必須是食品級的，不能含有非食品級功能性DNA片段。長久以來，人們構建了大量具有抗生素抗性標記的載體用于乳酸菌基因水平上的修飾。但由于抗生素抗性基因存在安全隱患，許多用于乳酸菌的食品級選擇標記已經發展起來，這些選擇標記是基于生物的天然性質，如糖發酵、氨基酸代謝、核苷酸生物合成和細菌的免疫抗性[3]。同時，一些基于環境壓力的新的選擇標記也得到開發，如熱休克蛋白、金屬抗性基因和細菌素抗性基因。Yin Sheng等采用膽汁鹽水解酶基因構建了乳酸菌的食品級表達載體[4]。在研究中，將能夠耐受壓力和可進行安全選擇的表達載體系統應用于食品工業，得名為“食品級”表達載體[2]。

1.2 宿主乳酸菌必須是食品級微生物

構建的“食品級”表達載體必須要轉化到宿主菌中才能發揮功能，所以轉化表達載體的宿主菌也必須具備生物安全性，我們一般都使用安全的、遺傳背景清楚且穩定的食品級微生物，如乳酸乳球菌（Lactococcus.lactis）、乳酸桿菌（Lactobacillus）及其它已經在食品工業中得到長期而廣泛應用的菌類。可以使用先進的分類方法對宿主菌進行鑒定，并通過適當的分子生物學手段闡明表達宿主的遺傳組成，如核苷酸測序、PCR擴增、DNA雜交等技術。此外，該宿主菌在生理狀況下，要能夠穩定在食品中定植或進入人和動物的消化道，并且能順利通過消化道的各種理化因素和酶屏障[5]。

1.3 表達所使用的誘導物必須是食品級

乳酸菌的表達系統按照基因組內啟動子的類型可以分為組成型表達系統（Constitutive expression system）和誘導型表達系統（Controlled/inducible expression system）。在乳酸菌中大量的蛋白質生產已經通過乳酸乳球菌組成型的啟動子獲得[2]。但是連續的高產量表達會導致細胞內蛋白質的積累、聚集甚至蛋白質的沉淀，這些都對細胞有害。為解決這些問題，研究了誘導型表達的啟動子，通過這些啟動子，基因表達可以被誘導物、抑制物、環境因素控制，比如pH、溫度和離子濃度[2]。乳酸菌食品級表達系統中所使用的誘導物必須是食品級的，如乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、乳鏈菌肽等可被人食用的物質[5]都能用來做誘導物。

2 乳酸菌食品級表達和標記系統

2.1 利用乳糖作為選擇標記的表達系統

乳糖是一類常用的食品級選擇標記。MacCormick等首先將實驗菌株L.1actis MG5276的質粒敲除，然后將完整的乳糖操縱子整合到其染色體上，通過雙交換使lacF基因失活，結果該菌株喪失了利用乳糖的能力（Lac-）。之后再將克隆有lacF基因的質粒轉到上述菌株中，該菌株恢復了利用乳糖的能力（Lac+）[6]。 Platteeuw 等將大腸桿菌（E.coli）中的β-葡糖醛酸酶基因（gusA）克隆到L.1actis乳糖操縱子lacA啟動子的下游，然后轉到缺失受體菌中，轉化后該菌能夠利用乳糖[7]，證明了乳糖可以作為一種有效的選擇標記。此外，Takala等構建了以乳糖合成酶為選擇標記的乳酸菌表達載體，并命名為PLEB600[8]。

2.2 Nisin誘導的食品級基因表達系統

Nisin是由乳酸乳球菌產生的一種小分子抗菌肽，由34個氨基酸組成，相對分子質量為3 510。Nisin對人體無毒副作用，進入消化道后被其中的蛋白酶作用從而失活，不會影響腸道的菌群平衡。FAO/WHO于1969年接受Nisin作為一種食品添加劑，現在Nisin已作為一種天然防腐劑在食品工業廣泛使用。Nisin的以上特性決定了它可以作為一種食品級誘導物在食品級表達系統中誘導異源蛋白的表達。

在Nisin自動調節過程中，Nisin通過一個典型的兩組分調節系統誘導了生物合成基因簇的轉錄，包括組氨酸蛋白激酶nisK和反應調節蛋白nisR[9]。當Nisin誘導了NisK，NisK發生自動磷酸化并且進一步將磷基團轉移到細胞內的反應調節蛋白nisR，nisR起到激活轉錄啟動子nisA/F的作用，并且誘導基因表達[10]。

基于Nisin生物合成的自動調節機制，de Ruyter等在1996年構建了NICE系統[11]。nisA啟動子被分離用于構建質粒，nisR和nisK基因被結合到合適的宿主菌的染色體上，當一個基因被克隆到一個質粒的PnisA基因下游并轉化到含NisinRK基因的菌中，克隆基因的表達可以被Nisin的加入而激活，Nisin首先誘導PnisA的轉錄，接著啟動基因表達。通過雙組分調節系統，表達基因的產物會在細胞中累積，也可以被分泌到細胞外，這依賴于構建過程中一個信號序列的存在與否[12]。許多報道證明了NICE系統在LAB中表達異源蛋白的多功能性和高效性[12-13]，其誘導效率可超過1 000倍以上[14]。

2.3 其它常用的食品級表達系統

以鹽為誘導物的表達系統也較為常用。Sanders等分離了一個氯化鹽誘導型乳酸乳球菌啟動子，并采用缺失作圖、核苷酸序列分析和引物延伸鑒定了這個鹽誘導啟動子，并用該啟動子成功表達了乳酸乳球菌Cre重組酶[15]。

利用乳酸菌發酵產乳酸，發展了pH誘導的表達系統。從乳酸乳球菌中分離到受pH調節的啟動子。該啟動子（P170）受低 pH、低溫等因子的正調節[5]。Madsen等對其進行了缺失突變，結果使P170的pH誘導作用提高150倍[16]。

此外，嘌呤、細菌素、抗金屬離子和噬菌體等作為選擇標記在乳酸菌食品級表達系統中也有一定程度的應用[1]。

3 乳酸菌食品級表達系統的最新應用

食品級乳酸菌系統因其高效表達的特點和應用性強的特征，很多蛋白質（酶、膜蛋白、細胞因子等）已經在乳酸菌體內得到表達應用，而其中利用乳酸菌制成的微生態制劑是廣泛使用的保健品之一。LIU等將腸道菌素P基因通過食品級表達系統在乳酸球菌中進行細胞外異源表達，得到了與腸球菌LM-2中的天然腸道菌素P相同相對分子質量、具有生物活性的腸道菌素P，標志著食品級系統表達水平的顯著提高[17]。近些年，食品級表達系統活躍于生物、食品、醫藥等各個研究領域，從最初的少數的幾種宿主菌株及與其相適應的質粒載體，到現在品種豐富且高效的食品級表達系統，從之前數量有限的、常見的表達產物，到現在各種營養食品、醫藥用品的層出不窮的表達產物的出現，乳酸菌食品級表達系統正發揮著越來越重要的作用。Neuter等構建了一種新的食品級表達系統—基于pSIP表達載體，以同源丙氨酸消旋酶基因作為選擇標記，以胚芽乳桿菌為宿主菌的表達系統，這個新系統適用于食品工業的添加劑和成分生產[18]。食品級的乳酸菌工程菌在食品、生物制藥等領域的有著廣闊的應用前景和商業價值。接下來，就乳酸菌食品級表達系統在食品、醫學和保健品上的最新應用做一歸納。

3.1 乳酸菌食品級表達系統在食品上的應用

GL Douglas等在L.acidopbilus染色體上插入編碼β-半乳糖苷酶的基因[19]，構建了產β-半乳糖苷酶的菌株，該重組菌應用于奶業生產中，提高了乳糖的水解率，從而提高了乳糖在人體中的吸收利用率，重組后的含風味酶基因的乳酸菌在食品生產與加工中不僅可以改善食品風味，還可以將一些合成營養物質的基因導入乳酸菌體內，生產出含高蛋白質的營養食品。

在發酵牛奶和奶酪的生產中，乳酸乳球菌菌株是一種在經濟上和科技上都非常重要的乳品前體培養物[20]。雷特氏乳酸球菌亞種MG1363是一種穿梭質粒型菌株，在遺傳學和生理學等領域都有非常廣泛的應用。該菌株中的dar基因是編碼二乙酰還原酶的基因，Karakas-Sen和Akyol將dar基因克隆在食品級表達載體pMG36e中。編碼二乙酰還原酶的基因在菌株MG1363中超表達，菌株新陳代謝的終產物在葡萄糖培養基上生長，從而獲得了二乙酰還原酶產物。而且，超表達dar基因的菌株和野生型菌株被用作奶酪生產中的前體培養物。與野生型菌株相比，在奶酪中發酵的兩個星期中可以檢測到不同水平的代謝終產物[21]。

3.2 乳酸菌食品級表達系統在醫學上的應用

乳酸菌能夠寄生于胃腸道，并被傳送至活體的黏膜水平，在人體臨床試驗中證實，乳酸菌可以減輕腸炎等疾病，從而提供了使用這種菌來治療其他疾病的可能性[22]。乳酸菌的這些特性使其能夠成為一種良好的生產藥物蛋白的重組菌[23]。

孫強正等將Mn-SOD基因克隆至食品級表達載體Psh91中，將該載體轉入乳酸乳桿菌中，在重組菌L.lactis MBP71成功表達了錳超氧化物歧化酶[24]。SOD具有很強的抗氧化能力，目前已在化妝品、食品及保健品等領域應用，并在一些疾病（如腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病以及輻射損傷等）的治療中顯示了良好的應用前景[25]。而食品級乳酸菌的表達產物與傳統方法中以大腸桿菌為宿主菌的產物相比，不需要經過復雜的純化過程就可以達到食品醫藥標準，為錳超氧化物歧化酶的應用提供了更廣闊的空間。

從病原菌、病毒和寄生蟲中分離出來的許多抗原已經在重組乳酸菌中生產出來[26-28]。最先構建的生產疫苗的重組乳酸菌是乳酸乳球菌MG1363，來生產破傷風毒素抗原[29]。從這之后就有了很多用不同種乳酸菌作為細胞工廠的例子，包括胚芽乳桿菌和干酪乳桿菌。兩項近期研究顯示，當抗原通過重組乳酸菌表達，融合入樹突狀細胞靶向肽[30-31]，就可以測定增長的免疫力水平。嗜酸乳桿菌NCFM和加氏乳桿菌ATCC33323表達樹突狀細胞靶向肽，融合炭疽桿菌保護性抗原之后讓小鼠口服，提供小鼠100%的抗炭疽能力，清晰的顯示出與簡單的抗原呈遞（30%的抗炭疽能力）有明顯的差異[30-31]。

患有乳糖不耐癥的個體，在攝入乳糖之后往往會出現腹瀉癥狀，而β-半乳糖苷酶可以幫助機體更好地使用乳糖，促進腸道菌株中的乳糖耐受性。Jingjie Li以乳糖不耐癥的小鼠為模型，將內生的β-半乳糖苷酶基因克隆入乳酸乳桿菌MG1363菌株中，通過讓小鼠口服MG1363菌液來進行試驗。結果顯示，在服用菌液之后的6 h內，總排泄物質量減少，腸道的運動性降低。這是乳酸菌食品級表達系統治療乳糖不耐癥的成功應用[32]。

Gao等使用食品級表達載體在乳酸乳球菌NZ9000中功能性地表達小鼠胰島素類似物Ι類生長因子（IGF-I）。小鼠胰島素類似物Ι類生長因子編碼序列被插入食品級表達載體pLEB688，轉化進入Lc.lactis NZ9000，通過SDS-PAGE和west blotting進行分析和驗證，證明該重組蛋白具有生物活性，促進了NIH3T3的細胞增殖。小鼠胰島素類似物Ι類生長因子在乳酸菌中表達之后被植入培養基中，在終產物質量濃度為100 ng/mL時，促進NIH3T3細胞增殖的能力達到最佳水平[33]。

3.3 乳酸菌食品級表達系統在保健品上的應用

乳酸菌在保健品方面的應用主要是作為微生態制劑，微生物制劑中廣泛使用的益生菌就是乳酸菌。市場上用于微生態制劑的菌種（包括乳酸菌）大多數都是野生菌株，而野生菌株所含有的抗藥因子的轉移，將對經濟、社會和生態造成潛在的危害[34]。食品級乳酸菌不含有抗藥性因子，排除了野生菌株造成的潛在危害。張麗芳等采用標準藥敏紙片瓊脂擴散法 （K-B法），以金黃色葡萄球菌ATCC25923作為標準對照，研究了15株乳酸球菌、14株乳酸桿菌、5株雙歧桿菌對8大類19種常用抗生素的敏感性，為研制益生菌食品級微生態制劑提供了科學依據[35]。乳酸菌微生態制劑能改善食物酸堿度、增加食欲、促進消化代謝、增強免疫力、保護生態環境，具有良好的應用前景。

4 展望

目前，多種食品級基因表達系統正在乳酸菌中建立起來，我們可以把一些與營養保健或疾病治療等相關的基因導入這種系統中制成制劑或疫苗，直接口服，從而簡化或免除了一般基因工程所需的復雜繁瑣的分離純化過程，為基因工程生產安全廉價的生物制品提供了一種新思路。

在蜂學研究領域，食品級表達系統的應用還比較少，幾乎還是空白。但是其潛在的應用價值還是值得我們研究和利用。蜂王漿中的主要王漿蛋白（Major Royal Jelly Proteins，MRJPs）占總蛋白質質量分數的46%～89%，是蜂王漿的主要成分。研究表明，MRJPs是由同源性很高的一系列蛋白質組成的蛋白質家族，這一家族共有9個成員。大量實驗證明，蜂王漿具有重要的醫療保健作用和生物學功能，這可能與王漿中的MRJPs密切相關[36]。因此，我們可以試圖將編碼王漿蛋白的基因導入乳酸菌食品級系統中，讓其在乳酸菌中獲得高效表達，這樣制成的乳酸菌食品不僅美味可口，而且極富營養價值。這樣也豐富了乳酸菌表達系統在食品工業領域的應用。

鑒于乳酸菌誘導表達系統的諸多優勢，乳酸菌“食品級”高效表達載體系統無疑將在發酵工程和口服功能性生物制劑方面得到巨大的發展，乳酸工程菌及其表達產物可以應用于食品、醫藥、保健品和工業領域，有巨大的應用前景和潛在的商業價值。

[1]郝鳳奇，楊桂連，葉麗萍，等.“食品級”乳酸菌表達載體系統的研究進展[J].中國預防獸醫學報，2008，30（10）：824-830.HAO Feng-qi，YANG Gui-lian，YE Li-ping，et al.The research development of “food-grade” LAB expression vector system[J].Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2008，30（10）：824-830.（in Chinese）

[2]De Vos W M.Safe and sustainable systems for food-grade fermentations by genetically modfied lactic acid bacteria[J].International Dairy Journal，1999，9（1）：3-10.

[3]Defoor E，Kryger M B，Martinussen J.The orotate transporter encoded by oroP from Lactococcus lactis is required for orotate utilization and has utility as a food-grade selectable marker[J].Microbiology，2007，153：3645-3659.

[4]YIN Sheng，ZHAI Zheng-yuan，WANG Guo-hong，et al.A novel vector for lactic acid bacterial that uses a bile salt hydrolase gene as a potential food-grade selection marker[J].Biotechnology，2011，152：49-53.

[5]張振中，陳秀珠，賈士芳.乳酸菌食品級基因表達系統[J].生物工程報，2002，18（4）：516-519.ZHANG Zhen-zhong，CHEN Xiu-zhu，JIA Shi-fang.Lactic acid bacteria （LAB）“food-grade” expression system［J］.Chinese Journal of Biotechnology，2002，18（4）：516-519.（ in Chinese）

[6]Maccormick C A，Griffin H G，Gasson M J.Construction of a food-grade host／vector system for Lactococcus lactis based on the lactose operon[J].FEMS MicrobiolLett，1995，l27（1-2）：105-109.

[7]Platteeuw C，Van A B，Van S S，et a1.Food-grade cloning and expression system for Lactococcus lactis［J］.Appl Environ Microbiol，1996，62（3）：1008-1013.

[8]Takala T M，Saris P E，Tynkkynen S S.Food-grade host／vector expression system for Lactobacillus casei based on complementation of plasmid-associated phosphor-beta-galactosidase gene lacG［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2003，60（5）：564-570.

[9]Kuipers O P，Beerthuyzen M M，De Ruyter P，et al.Autoregulation of nisin biosynthesis in Lactococcus lactis by signal transduction［J］.Biol Chem，1995，270：27299-27304.

[10]Kuipers O P，Beerthuyzen M M，Siezen R J，et al.Characterization of the nisin gene cluster nisABTCIPR of Lactococcus lactis：requirement of expression of the nisA and nisI genes for development of immunity［J］.Eur J Biochem，1993，216：281-291.

[11]De Ruyter P，Kuipers O P，Beerthuyzen M M，et al.Functional analysis of promoters in the nisin gene cluster of Lactococcus lactis［J］.Bacteriol，1996，178：3434-3439.

[12]Mierau I，Leij P，Van Swam I，et al.Industrial-scale production and purification of a heterologous protein in Lactococcus lactis using the nisin-controlled gene expression system NICE：the case of lysostaphin［J］.Microbial Cell Factories，2005，4：15.

[13]Miyoshi A，Poquet I，Azevedo V，et a1.Controlled production of stable heterologous proteins in Lactecoccas lactis ［J］.Applied and Environmental Microbiology，2002，68 （6）：3141-3146.

[14]Llull D，Poquet I.New expression system tightly controlled by zinc availability in Lactococcus lactis ［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，70（9）：5398-5406.

[15]Sanders J W，Leenhouis K，Burghoorn J，et al.A chloride inducible acid resistance mechanism in Lactococcus lactis and its regulation［J］.Mol Microbiol，1998，27（2）：299-310.

[16]Madsen S M，Amau J，Vrang A，et al.Molecular characterization of the pH-inducible and growth phase-dependent promoter P170 of Lactococcus lactis［J］.Mol Micribiol，1999，32（1）：75-87.

[17]Liu G，Wang H F，Griffiths M W，et al.Heterologous extracellular production of enterocin P in Lactococcus lactis by a food-grade expression system［J］.Eur Food Res Technol，2011，233：123-129.

[18]Nguyen T T，Mathiesen G，Fredriksen L，et al.Food-grade system for inducible gene expression in Lactobacillus plantarum using an alanine racemase-encoding selection marker[J].J Agric Food Chem，2011，59：5617-5624.

[19]Douglas G L，Goh Y J，Klaenhammer T R.Integrative food grade expression system for lactic acid bacteria［J］.Methods in Molecular Biology，2011，765：373-387.

[20]Wood B J B，Holzapfel W H.The genera of lactic acid bacteria［M］.London：Blackie Academic&Professional，1995：173-234.

[21]Karakas-sen A，Akyol I.Expression of dar gene in lactic acid bacteria and effect on metabolite formation in feta-type cheese quality［J］.Food Biotechnology，2012，26：45-57.

[22]Villatoro-hemandez J，Kuipers O P，Saucedo-cardenas O，et al.Heterologous protein expression by Lactococcus lactis［J］.Methods in Molecular Biology，2012，824：155-266.

[23]Daniel C，Roussel Y，Kleerebezem M，et al.Recombinant lactic acid bacteria as mucosal biotherapeutic agents［J］.Cell Press，2011，29：499-509.

[24]孫強正，熊衍文，李振軍，等.乳酸乳球菌食品級載體的構建及Mn-SOD基因的克隆和表達［J］.中國人獸共患病學報，2006，22（6）：498-501.SUN Qiang-zheng，XIONG Yan-wen，LI Zhen-jun，et al.Construction of the food-grade vector for Lactobacillus lactis and its use for cloning and expression of Mn-superoxide dismutase gene[J].Chinese Journal of Zoonoses，2006，22（6）：498-501.（in Chinese）

[25]Danel C，Erzurum S C，Prayssac P，et al.Gene therapy for oxidant injury-related diseases：adenovirus-mediated transfer of superoxide dismutase and catalase cDNA protects against hyperoxia but not against ischemia reperfusion lung injury［J］.Hum Gene Ther，1998，9（10）：1487-1496.

[26]Wwlls J M，Mercenier A.Mucosal delivery of therapeutic and prophylactic molecules using lactic acid bacteria［J］.Nat Rev Microbiol，2008，6：349-362.

[27]Berlec A，Strukelj B.Novel applications of recombinant lactic acid bacteria in therapy and in metabolic engineering［J］.Recent Pat Biotechnol，2009，3：77-87.

[28]Villatoro-hemandez J.Targeting diseases with genetically engineered Lactococcus lactis and its course towards medical translation［J］.Exp Opin Biol Ther，2011，11：261-267.

[29]Robinson K.Oral vaccination of mice against tetanus with recombinant Lactococcus lactis［J］.Nat Biotechnol，1997，15：653-657.

[30]Mohamadzadeh M.Dendritic cell targeting of Bacillus anthracis protective antigen expressed by Lactobacillus acidophilus protects mice from lethal challenge［J］.Proc Natl Acad Sci，2009，106：4331-4336.

[31]Mohamadzadeh M.Targeted expression of anthrax protective antigen by Lactobacillus gasseri as an anthrax vaccine［J］.Future Microbiol，2010，5：1289-1296.

[32]Li J J，Zhang W，Wang C，et al.Lactococcus lactis expressing food-grade β-galactosidase alleviates lactose intolerance symptoms in post-weaning Balb/c mice[QK/QT].（2012-02-06）[2012-3-15].http：//www.springerlink.com/content/l96u16214758u379/

[33]Gao G，Qiao J J，Yang C H，et al.Functional expression of mouse insulin-like growth factor-I with food-grade vector in Lactococcus lactis NZ9000.[QK/QT].（2012-03-08）[2012-3-15].http：//onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1472-765X.2012.03222.x/abstract

[34]劉晗璐，李光玉，孫偉麗.益生菌益生特性的研究進展［J］.中國畜牧獸醫，2010，37（2）：116-118.LIU Han-lu，LI Guang-yu，SUN Wei-li.The research progress of probiotics characteristics［J］.China Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2010，37（2）：116-118.（in Chinese）

[35]張麗芳，田洪濤，張玉蘭，等.健康人體及保健品中乳酸菌和雙歧桿菌的抗藥性分析［J］.中國食品學報，2009，9（6）：144-151.ZHANG Li-fang，TIAN Hong-tao，ZHANG Yu-lan，et al.The analysis of lactic acid bacterial and bifidobacterium drugresistance in healthy people and health products［J］.Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2009，9（6）：144-151.（in Chinese）

[36]Baitala T V，Faquinello P，de Toledo，et al.Potential use of major royal jelly proteins （MRJPs）as molecular markers for royal jelly production in Africanized honeybee colonies[J].Apidologie，2010，41：160-168.

[37]包秋華，呂嬙，于潔，等.四川牦牛奶和曲拉中九株乳酸菌的分子鑒定［J］.食品與生物技術學報，2012，31（4）：396-402.BAO Qiu-hua，Lu-Qiang，YU Jie，et al.Molecular identification of nine strains lactic acid bacteria isolated from yak milk and triton in Sichuan[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2012，31（4）：396-402.（in Chinese）