豬繁殖與呼吸綜合征病毒反向遺傳技術的研究進展

鄧雨修，王東東，潘永飛，周慶豐，蘇潤環，李春梅

（廣東溫氏集團研究院，廣東 新興 527400）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）誘發的急性接觸性傳染病，主要引起妊娠母豬的繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀。PRRS的病原具有遺傳多樣性，在世界上流行廣，防控難度大，所造成的經濟損失嚴重。豬繁殖與呼吸綜合征病毒屬于RNA病毒,利用反向遺傳學技術可以為其致病機制研究和新型疫苗的研制提供有效的技術平臺。以下主要從反向遺傳學技術在病毒基因功能研究中的應用及減毒活疫苗株拯救等方面進行闡述。

1 反向遺傳技術在PRRS病毒研究中的應用

PRRSV作為正鏈RNA病毒家族的一員，其基因組同時也作為mRNA，并具有感染性。直接將編碼病毒基因組的cDNA克隆轉染，或將體外由cDNA克隆轉錄出的病毒RNA轉染易感細胞就可以獲得完整的有感染性的病毒。因此反向遺傳學在PRRSV的研究中應用較廣，已滲透到了PRRSV研究的各個方面。

1.1 反向遺傳技術在PRRSV基因組結構和功能研究中的應用 隨著拯救技術的成熟，越來越多的研究者開始利用反向遺傳技術通過缺失、突變等操作對PRRSV的基因功能進行研究。Ansari IH等通過對GP5第34、44位和51位幾個糖基化位點進行突變，然后拯救后發現，第44位突變后不能得到活病毒，而第34和51位突變后的拯救病毒滴度要低于母病毒。接種豬后發現，突變后的病毒可以產生較高的中和抗體。Han J等通過對nsp2進行一系列的缺失操作后發現，nsp2的13～35位氨基酸是病毒復制的非必需區，高變區（324～813）可以承受100個或200個氨基酸的缺失，但是在324～726位不能全部缺失，最多容忍400個氨基酸的缺失。袁世山等對PRRSV的3′UTR進行了一系列的缺失、插入后發現，UTR區的5′端可以承受41個核苷酸的缺失和23個核苷酸的插入，并且發現，此區域保守的莖環結構區微小的改變便會破壞病毒的感染性。

Zhou Lei等構建了4個PRRSV全長cDNA感染性克隆，然后拯救出的相應毒株都能在MARC-145細胞中穩定復制，并且在SPF豬中檢測了上述拯救PRRSV的毒力，試驗表明30位氨基酸的缺失對中國流行的高致病性PRRSV的毒力沒有影響。Kwon B等對FL12基因組的不同位置進行了一系列突變，得到了不同的拯救病毒，發現nsp3～8以及ORF5上存在主要的潛在毒力位點；同時，nsp1～3、10～12以及ORF2上也可能有潛在的毒力位點。Chen Z等通過對nsp2上的B細胞表位進行缺失操作，發現這些區域對于PRRSV的復制并不必要，但對于調節宿主的免疫反應有著重要的作用。Kim等利用反向遺傳技術通過插入與缺失nsp2區域的有關序列，重構病毒，并對PRRSV的基因、氨基酸與其免疫原性和毒力的相互關系進行了深入探索，說明該技術在PRRSV中的應用已經達到了很高水平。

1.2 反向遺傳技術在PRRSV疫苗研究中的應用 在研制PRRS減毒活疫苗方面，與傳統的連續細胞傳代弱化毒株的方法相比，反向遺傳技術可以很容易地根據不同的流行毒株而改變相對應的保護性抗原，并且具有減毒途徑明確、效率高、毒力回復率低等優點。Fang Y等通過將nsp2編碼區的編碼抗原決定簇ES4基因敲除，換以編碼綠色熒光蛋白（GFP）基因，得到了表達nsp2-GFP融合蛋白的PRRSV，動物試驗表明該重組病毒可以在血清學上和野毒株區分開來，為以后標記疫苗的研制提供了依據。Tan F等在N蛋白中發現了一些區域，這些區域的缺失并不影響PRRSV在細胞中的活力，這些區域還可以作為外源tag等插入，而成為標記疫苗的候選。Lima M等通過去除特定的免疫顯性表位，得到了一系列毒株，進一步為標記疫苗的研制提供了證據。Wang Y等通過將強毒株MN184的結構蛋白部分和弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV的非結構蛋白進行嵌合，將MN184進行了致弱，提供了一種全新的、簡便的制備弱毒疫苗的思路。Pei Y等利用PRRSV的TRS序列，在P129中插入了GFP和PCV2的衣殼蛋白基因，同樣都得到了表達，表明PRRSV亦可以作為疫苗載體應用于豬疫病防治之中。

2 結語

反向遺傳學技術為研究PRRSV開辟了新途徑，利用該技術可以了解病毒生命活動過程中的各種調控機制,可以很容易地對病毒的復制及致病性分子機理進行研究，從而開發出相應的疫苗或藥物。反向遺傳操作技術最具潛力、最吸引人的應用在于對新型疫苗株的篩選，其優越性一方面在于可以解決疫苗研制的時效問題，另一方面可以通過體外基因修飾的方式，將決定毒力的基因敲除，同時又可引入分子標記以研制標記疫苗。時至今日，PRRSV與宿主的相互作用、致病機制及基因變異與重組機制等仍是研究熱點。而反向遺傳技術作為一種十分有效的研究工具，由于其自身所固有的優點，在未來的PRRSV研究中必將發揮出積極的作用。

參與文獻：

[1] Zhou L，Zhang J L，Zeng J W，et al.The 30-aminoacid deletion in the nsp2 of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerging in China is not related to its virulence[J].Journal of Virology，2009，83（10）：5156-5167.

[2] Kwon B，Ansari I H，Pattnaik A K，et al.Identification of virulence determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus through construction of chimeric clones[J].Virology，2008 Oct 25；380（2）：371-378.

[3]Chen Z，Zhou X，Lunney J K，et al.Immunodominant epitopes in nsp2 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus are dispensable forreplication，but play an important role in modulation of the host immune response[J].J Gen Virol，2010 Apr；91（Pt4）：1047-1057.

[4] Fang Y，Christopher-Hennings J，Brown E，et al.Development of genetic markers in the non-structural protein 2 region of a US type 1 porcine reproductive and respiratory syndrome virus:implications for future recombinant marker vaccine development[J].J Gen Virol，2008 Dec；89（Pt12）：3086-3096.

[5] Tan F，Wei Z，Li Y，et al.Identification of nonessential regions in nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus for replication in cell culture[J].Virus Res，2011 Jun；158（1-2）：62-71.

[6] Wang Y，Liang Y，Han J，et al.Attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain MN184 using chimeric construction with vaccine sequence[J].Virology，2008 Feb 20；371（2）：418-429.

[7] Pei Y，Hodgins D C，Wu J.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus as a vector:immunogenicity ofgreen fluorescent protein and porcinecircovirus type 2 capsid expressed from dedicated subgenomic RNAs[J].Virology，2009 Jun 20；389（1-2）：91-99.