副豬嗜血桿菌病的研究現狀

姜寶奎 劉宴博 （山東省萊陽市畜牧獸醫局 265200）

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副豬嗜血桿菌病的研究現狀

姜寶奎 劉宴博 （山東省萊陽市畜牧獸醫局 265200）

隨著豬場規模化、集約化程度的不斷提高，豬群飼養密度越來越大，呼吸道疾病逐漸成為繼繁殖障礙性疾病、胃腸道疾病之后危害養豬業的三大癥候群之一。特別是近年來，豬“高熱性”呼吸道疾病的蔓延和遷延不愈，尤其是副豬嗜血桿菌(，Hps)引起的以豬多發性漿膜炎、關節炎、呼吸困難、高熱及高死亡率為特征的傳染性疾病給養豬業帶來巨大的經濟損失[1]。隨著世界養豬業的發展，該病已成為全球范圍內影響養豬業的典型細菌性疾病，我國20 世紀90 年代才開始對該菌進行研究，而且主要集中在細菌分離鑒定、血清學鑒定、藥物敏感性試驗和臨床防治研究等方面。本文就副豬嗜血桿菌的病原學、流行病學、致病機理、菌株的分離鑒定及診斷和防制措施等方面的研究進展進行了綜述。

1 病原學

早在1910年，德國科學家Glsser就發現了副豬嗜血與豬的多發性漿膜炎和關節炎之間的聯系，最早Hjarre和Wramby將病原體稱為豬嗜血桿菌()，而Leece將病原體稱為豬流感嗜血桿菌()。在證明了該菌生長時不需要X因子(血紅素和其它卟啉類物質)的基礎上，該菌更名為副豬嗜血桿菌[2]。Hps是一種多形態、非溶血性、不運動、NAD依賴型、革蘭氏陰性細小桿菌，兼性厭氧。具多種不同形態的細菌，從單個球桿狀到長的、細長的以至絲狀菌體，常可見莢膜。其在巧克力培養基上培養24～48 h生長較差，為光滑型、灰白色透明、直徑大約0.5mm菌落。如與金黃色葡萄球菌共同培養時，HPS在葡萄球菌條狀菌苔附近呈衛星生長，生長良好，菌落直徑可達1～2 mm。HPS在血液瓊脂上呈小而透明的不溶血菌落，在加NAD、馬血清的M96支原體培養基或加NAD、馬血清和酵母浸出物的PPLO培養基上生長良好。生化反應為尿酶試驗陰性、氧化酶陰性、接觸酶試驗陽性，可發酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖和麥芽糖等。

Ruiz A等研究表明，外膜蛋白(OMP)與Hps的毒力有關，從健康仔豬與患病豬分離的Hps OMP不同，有多發性漿膜炎和關節炎癥狀的豬分離的Hps OMP基本相同。OMP蛋白質共有8種，大小分別約為9.2萬，8.8萬，5.3萬，6.0萬，4.6萬，3.7萬，3.1萬及1.5萬Da[3]。Charland等證明豬血清中轉鐵蛋白受體的存在，并分析兩種轉鐵結合蛋白(transferrin bindingprotein, Tbp)的多肽結構。TbpA和TbpB能夠特異的捕獲宿主的轉鐵蛋白，并將鐵轉運到細胞漿中，以提供細菌生長所需。Tbp在Hps感染宿主動物以引起發病起到決定性作用[4]。Lichtensteiger等指出，一種神經氨酸酶與細菌的宿主細胞內生長活性有關。該酶存在于細菌對數生長末期，提供細菌保持活力的非離子態鈣，他們隨后在Hps的分泌液中提純了這種有潛在毒力的神經氨酸酶，這進一步推動了Hps致病因子的研究[5]。

2 流行病學

引起豬傳染性胸膜肺炎的病原菌有3 種，即胸膜肺炎放線桿菌(AP)、豬嗜血桿菌(Hs) 和副豬嗜血桿菌(Hps)。副豬嗜血桿菌自1910年以來就作為病原菌而被認為是豬Glasser病的病原體。然而，直到90 年代才對其發病和防制進行了深入研究。由副豬嗜血桿菌引起的急性型疾病早期癥狀包括發熱、食欲不振和厭食，也可見到呼吸困難、關節腫脹、跛行、運動不協調、發紺、不愿活動以及死亡[6]。耐過急性發病的豬表現為被毛粗亂、咳嗽、呼吸困難和生長遲滯。有人報道了副豬嗜血桿菌引起的非典型癥狀，如猝死(通常由敗血性休克所致) 和非特異性呼吸道癥狀(呼吸困難、咳嗽) 和生長遲滯。急性型疾病的特征性病變是漿液性--纖維蛋白性多發性漿膜炎和多發性關節炎。近年來，還從細菌性肺炎、化膿性支氣管肺炎病變中分離到副豬嗜血桿菌，而且通常將此菌看作是繼發性病原菌。在豬繁殖與呼吸綜合征、II型豬圓環病毒所致疾病(斷奶豬多系統衰竭綜合征)、偽狂犬病及豬流感等感染之后，這類菌分離的頻率，甚至從漿液性--纖維蛋白性多發性漿膜炎病例中的分離頻率一直都在增高。按Kieletein-Rapp-Gabrielson(KRG)血清分型方法，目前副豬嗜血桿菌至少可分為 15 個血清型[7]，其中在德國 4、5 型最為流行[7]，在澳大利亞 5 型、13 型最為流行[8]，在美國5型最為流行[9]。同時，20%以上的分離株不能分型[10]。在我國，副豬嗜血桿菌在各豬場引起多發性漿膜炎和關節炎的報道屢見不鮮，已從北京、山東、黑龍江、遼寧、河南、湖南、寧夏、湖北等省市分離出副豬嗜血桿菌。

除了KRG血清分型方法之外，研究者也嘗試用整個細菌體裂解產物進行SDS- PAGE 電泳，對副豬嗜血桿菌進行分型，結果除KRG血清型1型為SDS -PAGE III型外，其它血清型，如5型、6型、10型均屬SDS- PAGE I型。HPS只感染豬，可以影響從2周齡到4月齡的豬，主要在斷奶前后和保育舍階段發病通常見于5～8周齡，發病率可達40%，嚴重時死亡率可達50%。通常可從健康豬的鼻腔分泌液中分離出病菌，還可以從患肺炎豬的肺臟中分離出來。在分離的15 種血清型菌株中，1、5、10、12、13、14型毒力最強，患豬歸于死亡或處于瀕死狀態；2、4、8、15型為中等毒力，患豬死亡率低，但出現敗血癥狀，生長遲滯；3、6、7、9和11型毒力較低，患豬沒有明顯的臨床癥狀。

3 致病機理

呼吸道中的HPS可引起上呼吸道黏膜表面纖毛活動顯著降低，損傷纖毛上皮，引起膿性鼻炎；病灶處由于纖毛丟失，鼻黏膜和支氣管黏膜急性腫脹，黏膜損傷，從而增加細菌入侵機會。有研究表明，豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒等能降低豬肺泡巨噬細胞的吞噬和殺菌能力，從而增加了Hps的感染機率。Hps的一種可溶性毒素可能與所觀察到的細胞病變有關[10]。Lichtensteiger等的研究表明，90%以上的現場分離菌株都產生神經氨酸苷酶(唾液酸酶)，這種酶與透酶和醛縮酶協同作用，通過奪取宿主細胞的碳水化合物而增強細菌毒力。除了對營養方面的影響以外，神經氨酸苷酶還介導清除與宿主細胞糖原結合的唾液酸，從而暴露出細菌定居或侵入宿主細胞所需的受體，并通過降低黏蛋白的黏性從而干擾宿主的防御系統[5]。

另外，很多學者們認為，Glasser 病流行病學的改變在一定程度上是因為副豬嗜血桿菌在幼豬體內的定居模式所致，而這些定居模式則受到管理方法(比如隔離或早期斷奶)的影響。這些觀點可以歸納為：（1）仔豬可在不同時間被母豬排出的Hps所定居，定居時間取決于母豬的免疫力水平和母豬的細菌排出水平；（2）在一定的日齡，斷奶豬中只有一定比例的個體被Hps定居，這一比例可隨斷奶日齡的增大而增加；（3）斷奶時被Hps定居仔豬的比例較低時，則在保育舍內細菌從定居仔豬向非定居仔豬的傳播會很慢；（4）在母源免疫力消失后受到感染的仔豬會發病。

4 分離與鑒定

在一般條件下，HPS難于分離和培養，尤其是應用抗生素治療過的病豬病料，給本病的診斷帶來了許多困難。因此，對于許多獸醫來說，從臨床樣品中分離HPS仍是一個挑戰。雖然用PCR可以檢出臨床樣品中的HPS，但是，要通過血清分型與基因分型對分離物進一步定性，還必須進行分離。許多因素都可能會影響到HPS的分離，包括選擇采樣的動物和在樣品提交給診斷實驗室之前對樣品的處理。研究表明，采取以下措施可以提高從臨床樣品中分離HPS的機會。

4.1 采樣動物的選擇 很少能從死豬中分離出HPS。為了提高分離的機會，應當對表現急性感染臨床癥狀的未治療豬進行無痛處死并采樣。雖然最好選擇表現有呼吸窘迫(腹式呼吸、咳嗽)和關節腫脹的豬采樣，但是，對表現有中樞神經系統癥狀的豬也可以考慮，重要的是要從慢性病變中區分急性病變。在保育期暴發中存活的豬可能在肥育初期發生臨床癥狀。這些臨床癥狀可能與胸，腹腔發生纖維化有關。一般不能從慢性感染豬分離出HPS。

4.2 采樣部位的選擇 HPS是上呼吸道中一種共棲微生物。由于可以從健康動物的鼻腔、扁桃體、氣管中分離出HPS。因此，分離HPS的理想部位是腦(腦膜)、心包、胸膜、腹膜和關節。在觀察到纖維蛋白性胸膜炎時可以提交肺組織。在某些情況下，HPS只引起肺炎。從肺炎肺回收到分離物可能表示或不能表示侵襲豬群的“問題”菌株。雖然HPS可以引起敗血癥，并且可以表明在血液中發生急性感染，但是，并不常使用從現場病例采集的血液樣品進行分離。

4.3 采樣方法的選擇 可以用無菌拭子采集供分離HPS用的樣品，并將拭子置于含有Stuart或Amies培養基的運送系統中呈送。Amies系統保持HPS的活力比Stuart系統更好。應當用拭子采集器官表面上的纖維蛋白滲出物樣品。免疫組織化學研究表明，在纖維蛋白滲出物中通常含有豐富的HPS細胞。可以用無菌注射器采集關節、腹膜、心包以及胸腔中的液體。HPS在組織中比在拭子中存活時間長。由于在同一頭豬的不同部位可能分離出不同的HPS株，所以提供的組織樣品應當單獨包裝呈送。可以從活動物采樣而無須進行無痛處死。例如可以用無菌注射器和針頭從腫脹關節采集滑液。采樣后樣品應當立即冷凍。

4.4 供分離用樣品的呈送 HPS對溫度敏感。在42℃下的生理鹽水中1h、37℃下2h及25℃下8h HPS即不能檢出。但在冷藏溫度(4℃)下，HPS可以存活較長時間。采集供分離HPS的樣品應當盡可能快的呈送診斷實驗室(1～2d)。拭子、組織樣品或含有體液的注射器應當用冰鎮容器呈送。組織應當新鮮呈送，不要使用福爾馬林保存。

5 診斷和防制措施

首先，可以根據臨床癥狀進行初步診斷。其臨床癥狀為：豬病早期病象包括被毛粗亂、精神沉郁、發熱(40.5~42.0℃)、厭食，也可見到呼吸困難、關節腫脹、運動不協調、皮膚紫斑。病豬經常起臥，長聲尖叫，顫抖，共濟失調，可視黏膜發紺，跛行。一個或幾個關節腫脹、發熱和疼痛，多見于腕關節和跗關節。許多病例出現腦膜炎癥狀。耐過急性發病的豬可以痊愈，但受害嚴重者會留下后遺癥，即母豬流產，公豬慢性跛行。

確診必須進行實驗室檢查。由于在死亡病例較難分離到HPS，一般應選取典型病例人工處死。同時應注意的是，僅從鼻腔、扁桃體或氣管等組織臟器中分離細菌，對于評估是否由HPS引起的致病是沒有意義的，應從全身多個部位如心包、關節、心血、腦脊液等處進行病原分離。目前，用于HPS診斷的血清學方法有：瓊脂擴散試驗、補體結合試驗、間接血凝試驗等[2]。由于在一個豬群中，出現HPS的幾種菌株或幾種血清型毒株同時感染的現象比較普遍，甚至在個別病例，不同標本內可發現不同菌株或血清型感染，各血清HPS之間存在交叉反應，因此診斷意義不大。國內和國際上現都已開發出HPS的PCR診斷方法，可用于HPS的快速診斷，具有很高的靈敏度。

事實證明，副豬嗜血桿菌病的防治治僅使用抗生素來預防和治療，效果往往得不償失，要徹底解決豬場的副豬嗜血桿菌病問題，還必須依靠有效的疫苗。接種疫苗是控制HPS病的有效方法之一。如果將在豬群中引起發病的 HPS菌株應用在菌苗之中(商品苗或自家苗)，則可能成功地產生保護。讓豬接觸無致病力的 HPS菌株，也可誘發其對有毒菌株的抵抗力。已有報道能成功地使用商業化或自家菌苗預防和治療本病，但也有一些菌苗缺乏效力的事例，這可能是因為病程中出現菌株的血清型不同而缺乏交叉保護力。由于菌株致病力的差異，以及當前對保護性抗原和毒性因子缺乏深刻的認識，還不可能有一種滅活疫苗同時對豬所有的致病菌株產生交叉免疫力。因此，在應用疫苗免疫的基礎上，應加強對感染豬群中所有豬的抗生素治療。同時，對HPS繼發感染性疾病，要加強對原發病的控制和治療，加大養豬場生物安全管理，減少或消除其它呼吸道病原物。此外，Takahashi 等通過臨床和實驗室研究表明，HPS血清2型和5型制備的二價疫苗比單價疫苗更能有效地保護豬群，可防止HPS病的暴發，二次免疫后保護期可達79d，這進一步證明各血清型間交叉保護力低，多價苗的免疫效果比單價苗的更好。因此，多價苗的研制將是 HPS疫苗今后的一個發展方向。

防治方案包括抗生素治療和免疫接種，同時還要配合以優良的管理措施，以減少或消除其它呼吸道病原。加強飼養管理，減少各種環境應激，增強豬的抵抗力，加強隔離消毒，實行統一日齡斷奶以及嚴格的全進全出制，杜絕將各生產階段的豬或不同來源的豬混群飼養等。

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（2012–06–15）

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1007-1733(2012)09-0090-03