尼帕病毒病診斷技術

孫麗麗 （山東省諸城市畜牧獸醫管理局 262200）

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尼帕病毒病診斷技術

孫麗麗 （山東省諸城市畜牧獸醫管理局 262200）

尼帕病毒病是由尼帕病毒(Nipah virus)感染引起的人畜共患病。其特征為急性發熱性腦炎和高死亡率。病原體是副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)的亨尼帕屬(Henipavirus)成員，毒力強。本文就尼帕病毒病診斷技術進行簡要概述。

1 病原學診斷技術

1.1 病毒分離 在無菌情況下處理受檢樣品。用密閉的勻漿器處理含10%(w/v)組織樣品的懸浮液，如在密閉的金屬筒中用高壓滅菌的金屬球進行研磨，或者在罩袋式勻漿器中進行研磨。樣品磨碎后，300g離心，將上清加入到培養的Vero細胞或兔腎細胞(RK-13)中。NiV感染細胞后，引起的CPE的特征是出現細胞融合現象：經過24~48h，有些融合的細胞可含有60個以上的細胞核，并且融合細胞的細胞核分布在融合細胞的周圍。如果沒有出現CPE，應該再盲傳2次，每次培養5d。

1.2 分子生物學診斷 對于Nipah病毒與Hendra病毒的診斷，PCR檢測是很常規的方法，AAHL所建立的方法，是基于Nipah病毒與Hendra病毒的M蛋白基因的保守序列所設計的引物，進行巢式PCR擴增。這種RT-PCR方法可以用于固定的或新鮮的組織樣品進行診斷，或對腦脊髓液進行診斷，也可以對細胞培養分離物進行快速鑒定。在美國CDC使用的是另一種方法，這種PCR是基于N基因之上的，在剛開始使用的PCR方法是基于P基因。Real time–PCR具有快速、準確的特點，也被應用于對這兩種病毒的檢測，Smith等首先建立了針對Hendra病毒M基因的Real time–PCR檢測方法，可以在4h內得到檢測結果。Guillaume等建立了針對Nipah病毒N基因的Real time–PCR檢測方法，檢測靈敏度能達1PFU的病毒量，該方法適合對自然感染樣品或流行病學樣本進行檢測。

1.3 組織病理學診斷 免疫組織化學包括免疫熒光，免疫酶染色試驗，金標記抗體試驗等，被證實是檢測Nipah病毒最有效的方法之一。通過福爾馬林固定組織，這種方法不僅安全，而且還可以對以前采集的組織病料進行回顧性調查。免疫組化試驗檢測部位包括腦組織、肺臟、腸系膜淋巴結、腎臟等，懷孕動物還應該送檢子宮、胎盤以及胎兒組織等。

2 血清學診斷技術

2.1 血清中和試驗 血清中和試驗在某種程度被當作結果判定的標準方法(Golden standard)，對于通過其他試驗所得到的陽性或可疑結果，均需要通過血清中和試驗進行驗證。其操作是在P4條件下，血清和病毒在96孔中預先溫育后，再加入到有Vero細胞的孔中，血清篩選使用的稀釋度為1:2(對于血樣來源貧乏者，例如所采集的動物是瀕死的飛狐和小蝙蝠，初始的血清稀釋度可以設為1:5)，這種稀釋度偶爾會產生細胞毒性。培養3d后觀察結果，那些徹底阻止出現CPE的血清記為陽性。

2.2 ELISA檢測 ELISA方法以其敏感、快速和高通量的特點，非常適合作為流行病學調查和血清學篩查工具。由于Nipah病毒與Hendra病毒有交叉反應，因此早期在馬來西亞是使用滅活的Hendra病毒來作為檢測抗原的，并建立了血清IgM、IgG的檢測方法。Ramasundram等研究表明，病人感染4d后，腦脊液中的IgM抗體陽轉率為65%，而12d后陽轉率達到100%，并可維持3個月的時間，感染后25dIgG抗體陽轉率為100%。

由于該病毒高度危險，一般的實驗室不能進行病毒的培養，所以使用基因工程表達的重組蛋白作為檢測抗原顯示了良好的應用前景，在未出現該病毒的國家，特別適合應用這種方法生產抗原來進行流行病學調查。利用原核系統對Nipah病毒N蛋白進行重組表達，表達產物能很好的和感染豬血清中的抗體反應；用桿狀病毒表達系統對Nipah病毒N蛋白進行表達，檢測結果提示重組N蛋白可以代替全病毒作為ELISA檢測抗原。分別在桿狀病毒表達系統和大腸桿菌中對Nipah病毒G的胞外區基因進行表達，結果發現表達的蛋白作為抗原適用于常規的Nipah病毒抗體檢測，也可以應用于血清學的流行病學調查。盡管ELISA方法特異性較高，但其判定條件需要仔細評估，對陽性樣本現在通常使用血清中和實驗進行驗證，只有那些在兩個體系中均反應的樣本才能被認為是陽性的。采樣時需要在第一次采樣以后3周時，再抽樣檢測1次，以便留下時間使陽轉的血清得以檢出，如此反復的檢測，一直到確信感染在整個被檢測的畜群中被消除了為止。

2.3 單抗檢測 單抗具有特異性強，敏感性高的特點廣泛應用于對病原及其特異性抗體的免疫學鑒定，目前已經有關于針對兩種病毒單抗制備及其在診斷實驗中應用的報道。用福爾馬林滅活的Nipah病毒作為抗原制備8株單克隆抗體，將這些單抗應用于免疫組化實驗，其中有2株單抗只和Nipah病毒感染的豬肺臟組織反應，而不和Hendra病毒感染的馬肺臟組織反應，顯示這兩株單抗在鑒別診斷方面具有獨特的作用。利用其中1株針對Nipah病毒的特異性單抗，建立了一種阻斷ELISA方法，可檢測感染豬血清中的Nipah病毒抗體，結果和血清中和實驗有很好的符合率，這種方法也可以應用于對各種動物血清抗體的檢測。利用滅活的Nipah病毒免疫小鼠，制備5株針對Nipah病毒的IgG單抗，通過Western blot鑒定了這些單抗針對的特異性結構蛋白，其中4株是針對N蛋白的，1株是針對M蛋白的。在體外實驗中，所有的單抗均沒有中和作用，所有單抗均可用于ELISA實驗和免疫熒光實驗，但是F45G2(抗N)最適合做長時間福爾馬林固定組織的免疫熒光；三株針對N的的單抗能和Hendra病毒N產生交叉反應；一株針對N的和一株針對M的單抗不和Hendra病毒產生交叉反應，顯示在未來的實驗中具有鑒別診斷意義。

（2012–05–14）

S855.3

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1007-1733(2012)09-0042-02