麻鴨源性鮑氏不動桿菌的分離與鑒定

吳 白 劉丹丹 陳 玉 王彥紅 劉文博 （揚州大學動物醫(yī)院 江蘇 揚州 225009）

鮑氏不動桿菌是一種不發(fā)酵糖類、氧化酶陰性、硝酸鹽還原陰性、不能運動的革蘭氏陰性桿菌，是人類和動物皮膚、呼吸道和胃腸道常見的條件致病菌[1]。隨著抗菌藥物的不合理使用，細菌對抗生素的耐藥性尤其是多重藥物耐藥性嚴重地危及著抗感染疾病的治療[2,3]。本試驗從麻鴨的肝臟內分離到一株革蘭氏陰性短桿菌并進行了藥敏試驗。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病情況 2011年8月?lián)P州高郵某農戶，帶來3只50日齡麻鴨到揚州大學動物醫(yī)院就診，共飼養(yǎng)100只，已死亡20只。麻鴨病程3d左右，于35日齡時注射H5N2禽流感病毒疫苗。病死麻鴨剖檢發(fā)現(xiàn)：肝、氣囊、心表面有纖維性滲出物附著；肝脂肪變性；脾紋理明顯腫大；心肌刷狀壞死、出血；腸道有較多環(huán)狀壞死。

1.2 細菌分離 取麻鴨的肝組織在無菌環(huán)境下接種于LB瓊脂平板上，經37℃24h培養(yǎng)后，觀察結果。在LB瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)基上繼續(xù)純培養(yǎng)，觀察LB瓊脂平板和麥康凱培養(yǎng)基上細菌的生長狀況。挑取單個致病菌落進行革蘭氏染色，然后鏡檢。

1.3 生化試驗 利用細菌微量生化反應管對所分離菌株進行生化指標測定[4］。37℃培養(yǎng)24h后觀察結果。

1.4 藥敏試驗 采用紙片瓊脂擴散法，藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司，操作方法和判定標準參照該公司操作方法與標準。藥敏紙片有：痢特靈300μg/片，丁胺卡那霉素30μg/片，羅美沙星10μg/片，強力霉素30μg/片，氯霉素30μg/片，左氟沙星5μg/片，慶大霉素10μg/片，卡那霉素30μg/片，氟哌酸10μg/片，萘啶酸30μg/片，菌必治30μg/片，鏈霉素10μg/片，復方新諾明1.25/23.75μg/片，多粘菌素B300U/片，美洛西林75μg/片。

1.5 小鼠致死實驗 待檢菌株用LB平板37℃培養(yǎng)24h，在 平板中注入無菌生理鹽水，吸取稀釋液腹腔接種6周齡ICR小鼠2只，一只0.15ml，另一只0.2ml，觀察24～72h，同時對死亡小鼠分離菌株。

1.6 16S rDNA基因測序法 將分離菌采用煮沸裂解法制備細菌基因組DNA模板，按照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(寶生物工程(大連)有限公司)方法操作，PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定后，用Agarose Gel DNA Extraction Kit(Roche公司)回收，回收產物送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序；將測定的序列在NCBI網站進行BLAST搜索比對，鑒定細菌種屬。

2 結果

2.1 細菌鏡檢 在LB瓊脂平板上形成淡黃色圓形菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上生長，菌落呈淡粉紅色。革蘭氏染色的鏡檢結果為革蘭氏陰性短桿菌，散在出現(xiàn)，兩端鈍圓。

2.2 生化試驗結果 細菌在37℃培養(yǎng)24h后，生化試驗結果顯示分離菌株不能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖等糖類，氧化酶陰性、硝酸鹽還原陰性，生化結果符合鮑氏不動桿菌的特點。

2.3 藥敏結果 藥敏試驗參照藥敏試驗判斷標準，結果顯示高度敏感的藥物有丁胺卡那霉素、卡那霉素、慶大霉素；對痢特靈、左氟沙星、氯霉素、羅美沙星中度敏感；對強力霉素、氟哌酸、萘啶酸、菌必治、鏈霉素、復方新諾明、多粘菌素B、美洛西林等耐藥。

2.4 小鼠致死效果 細菌稀釋液腹腔接種2只6周齡ICR小鼠24h后都死亡，在無菌環(huán)境下對死亡老鼠的肝臟做觸片進行美藍染色。注入0.15ml細菌稀釋液的老鼠肝臟邊緣變黑，在顯微鏡下可見桿狀細菌散在或成對出現(xiàn)。另一只注射0.2ml的老鼠肝臟已大部分變黑，做觸片美藍染色后亦可見較多的桿狀細菌。

2.5 基因測序結果 通過因特網在NCBI 的Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中對分離菌株測序結果進行檢索。結果顯示此細菌是鮑氏不動桿菌。

3 討論

（1）從病死鴨分離到一株細菌，因為此細菌的形態(tài)結構、生化特性等較少見，應用16S rDNA基因測序法快速鑒定分離菌顯示為鮑氏不動桿菌，確定分離菌后對照其細菌培養(yǎng)、生化特性等亦符合鮑氏不動桿菌的生物學特性。由于細菌菌株的16S rRNA基因分子結構上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量信息，使16S rRNA基因成為了公認的細菌分類指標[5]，因而將測定細菌的16S rRNA 基因進行序列分析，運用于細菌的鑒定。16S rDNA序列分析是目前較好的快速而直接的檢測微生物的分子生物技術的方法之一，已經被廣泛使用[6]。（2）鮑氏不動桿菌廣泛分布于自然界、存在于土壤、飲水、污水及食品中。鮑氏不動桿菌是不動桿菌在臨床感染病例中出現(xiàn)率最高的，感染區(qū)域多在醫(yī)院，最主要的是由于呼吸道感染[1]。鮑氏不動桿菌在人感染上已有較多報導[7,8]，在動物上的較少。鮑氏不動桿菌在環(huán)境中大量存在，抵抗力較強，并且對抗生素有廣泛的抗性，在水中繁殖被麻鴨攝入體內造成麻鴨感染。鑒于藥物在集約化養(yǎng)殖中使用日益廣泛，鮑氏不動桿菌對動物致病的機會也日益增多，應予重視[9]。（3）鮑氏不動桿菌極易產生耐藥性，藥敏試驗結果顯示本次分離菌株對丁胺卡那霉素、卡那霉素、慶大霉素敏感，對多數(shù)抗菌素是耐藥的，如對菌必治，美洛西林等頭孢菌素類藥物耐藥，與許慧等報道結果相符[10]。因此需加強養(yǎng)殖戶對預防鮑氏不動桿菌感染的知識，同時對養(yǎng)殖戶進行濫用抗生素帶來的危害等知識普及，使抗生素的使用更加合理化、科學化。針對藥敏試驗結果可選用其中一種敏感藥物拌飼投喂，并定期對麻鴨生活的水環(huán)境進行消毒，改善水質以減少病原菌。

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