GLP－1調控胰島細胞增殖、凋亡的信號分子機制及中西藥的研究

鄭遠燕 施 紅 崔 乙

(福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建省福州閩侯上街大學城華佗路1號，350108)

1 GLP－1的基本性質

早在上世紀80年代，McIntyre和Elrick等人就發現，口服葡萄糖對胰島素分泌的促進作用明顯高于靜脈注射，這主要由腸促胰素引起，即由胰高血糖素樣肽－1(Glucagon－like Peptide－1，GLP－1)和糖依賴性胰島素釋放肽(Glucose－Dependent Insulintropic Polypeptide，GIP)組成的腸肽所致，其中GLP－1在2型糖尿病的發生發展中起著更為重要的作用。GLP－1有2種生物活性形式，即GLP－1(7－37)和GLP－1(7－36)酰胺，二者僅有一個氨基酸序列不同。其中，約80%的循環活性來自GLP－1(7－36)酰胺［1］。GLP－1主要由胃腸黏膜 L細胞分泌，易被二肽基肽酶(Dipeptidyl peptidase 4，DPP－Ⅳ)降解，半衰期約為2min，主要通過與GLP－1受體特異性結合而發揮生物作用。

2 GLP－1的主要生物學作用

GLP－1受體屬于β受體家族的G蛋白偶聯受體，分布廣泛，使GLP－1作用呈多效性。1)作用于胰島β細胞，保護β細胞，促進胰島素基因的轉錄、胰島素的合成和分泌，刺激胰島β細胞的增殖和分化，抑制胰島β細胞凋亡，增加胰島β細胞數量;2)作用于胰島α細胞，強烈地抑制胰高血糖素的釋放;3)作用于胰島δ細胞，促進生長抑素的分泌，通過旁分泌間接抑制胰高血糖素的分泌;4)作用于胃，抑制胃腸蠕動、胃酸分泌，延緩胃排空;5)作用于中樞，可保護神經，抑制攝食和食欲，增強學習、記憶能力;6)作用于肝，減少肝糖原的輸出;7)作用于心血管，可增強心功能，血管內皮依賴性擴血管;8)作用于肌肉、脂肪組織，可增加葡萄糖的攝取和利用［2］。簡言之，即GLP－1可以降低血糖、血脂、血壓，減輕體重。

3 GLP－1調控胰島細胞增殖、凋亡的信號分子機制

3.1 GLP－1調控胰島細胞增殖 GLP－1作為β細胞的有絲分裂因子，具有誘導β細胞增殖和分化的直接作用。崔岱等［3］人用GLP－1與大鼠胰島細胞瘤細胞株RINm5f共育，結果GLP－1可呈劑量與時間依賴性地促進大鼠胰島細胞瘤細胞RINm5f的增殖，而敲除胰腺－十二指腸同源盒因子1(PDX－1)基因的小鼠，GLP－1促進胰島細胞增殖的作用消失。PDX－1基因的表達產物是胰腺生長發育的主要調控因子，在胚胎發育9.5～13.5d時可促進胰腺小芽生長與發育，使其具有正常的形態和細胞數量，隨后移向內分泌部位，誘導胰腺干細胞分化為不同的內分泌細胞，是β細胞分化和成熟的核心調控因子［4］。GLP－1可以影響PDX－1的DNA結合活性、反式激活潛能以及PDX－1的基因表達［5］。GLP－1作為化學信息與細胞膜上的G蛋白偶聯受體相結合，使Gs變構后與ATP結合激活，進而激活細胞膜上的腺苷酸環化酶(Adenylate Cyclase，AC)，生成cAMP，cAMP作為第二信使，在細胞質內激活蛋白激酶A，刺激PDX－1和依賴半乳糖的激活蛋白4(GAL4)的DNA結合區連接的載體活性，上調PDX－1的基因表達［5］。無論在體外還是在體內，GLP－1均能促進PDX－1的合成，提高PDX－1含量并加速其轉移進入細胞核中，上調PDX－1的基因表達，進而促進β細胞增殖。GLP－1還可以誘導2種胰腺導管細胞系ARIP和PANC－1分化為能合成并分泌胰島素的細胞，但GLP－1的促分化作用需要轉錄因子PDX－1的表達，因為ARIP只有在轉染PDX－1基因后才會分化，這說明GLP－1和PDX－1在調節β細胞增殖和分化的作用方面存在內在的聯系。GLP－1還可以通過cAMP/PKA使Ras超家族中的GTP酶活化，激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs);此外cAMP還可以以不依賴PKA的方式，通過與β細胞中cAMP調節的鳥苷酸交換因子(GEF)相互作用，激活Ras/MAPK信號通路，促進β細胞的生長和分化［6］。最近有研究者發現，GLP－1可以使肥胖的高血糖大鼠出現胰島的生長，使β細胞的增殖增加［7］。在胰島功能實驗中獲知經典WNT信號通路能促進胰島增殖。在分離的胰島和胰腺β細胞系，大鼠胰島素細胞(INS－1)中，GLP－1可以激活Wnt信號通路，促進β細胞的生長和存活。GLP－1通過自身受體GLP－1R激活PI3K－AKT通路，使葡萄糖合成酶3β激酶(Glycogen Synthase Kinase—3β，GSK3β)磷酸化失活而穩定β－環連蛋白(β－catenin)，促進β－catenin/TCF7L2表達，誘導β細胞增殖［8］。

綜上可見在調控β細胞增殖的調節網絡中，GLP－1處于網絡的頂端，發出β細胞增殖的啟動信號，調節β細胞增殖，主要途徑有三條:1)GLP1—GLP1R—AC—cAMP—PKA—MAPK/PI3K—PDX － 1;2)GLP1—GLP1R—AC—cAMP—GEF—Ras/MAPK;3)GLP1—GLP1R—PI3K—AKT—GSK3β—β － catenin—TCF—Cyclin D2。

3.2 GLP－1調控胰島細胞凋亡 GLP－1可降低血糖和游離脂肪酸，抑制糖毒性和脂肪毒性，間接保護β細胞，維持β細胞量。崔岱等［9］研究發現GLP－1促進胰腺轉錄因子如NKX2.2、PAX以及葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖轉運體2(GLUT2)的基因表達，改善糖脂毒性對β細胞功能的影響，抑制β細胞凋亡。主要通過以下幾個途徑:1)降低血糖，間接減少促凋亡基因Bad、Bid、Bik的表達，增加Bcl－xl抗凋亡基因的表達［9］;2)抑制活性氧簇(ROS)、活性氮簇(RNS)等對DNA、蛋白質、脂質、大分子物質的損傷及其下游的核因子κB(NF－κB)、p38 MAPK、NH3末端 Jun激酶應激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)、己糖胺等［10－12］;3)下調Fas受體、抑制 FasL表達，從而使促凋亡基因caspase表達降低［13］;4)抑制酰基鞘醇產物、NF－KB等［14］。

此外，GLP－1還能直接作用于β細胞或胰島前體細胞GLP－1R，激活受體后信號轉導以抑制β細胞凋亡。GLP－1與其受體結合后，通過cAMP激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3－kinases，PI3K)及其絲裂原活化蛋白激酶(MAPK/ERK)、蛋白激酶 A(PKA)、蛋白激酶B(PKB/Akt)等信號轉導途徑，抑制促凋亡蛋白，如胱冬酶(caspase－3)表達和促進抗凋亡蛋白，如Bc1－2、Bcl－xl表達，從而抑制了β細胞的凋亡［15－16］。Wang等［17］研究證實 GLP －1 還可通過激活PKB途徑抑制胰島細胞系INS－1的凋亡。此外，GLP－1還能通過激活斯里蘭卡肉桂堿受體(RyR2)和抑制鈣蛋白酶的活性抑制 β細胞的凋亡［18］，通過cAMP—CREB(cAMP反應元件結合蛋白)—IRS2(胰島素受體底物2)—Akt途徑促進細胞存活［19］。

可見GLP－1抑制胰島細胞凋亡主要通過三個方面:1)抑制炎癥應激白細胞介素－1β(IL－1β)、腫瘤壞死因子α(TNF－α)、γ干擾素(IFN－γ)等誘導的凋亡;2)抑制促凋亡基因caspase3的表達，增強抗凋亡基因Bcl－2、Bcl－xl的表達;3)直接降低血糖、游離脂肪酸(FFA)，抑制糖脂毒性引起的細胞凋亡。

4 中西藥的研究

4.1 GLP－1相關西藥 鑒于GLP－1的作用，其相關新藥的研發顯然已成為2型糖尿病藥物治療研究的新熱點，研究者主要從2個方面開發GLP－1的相關新藥:1)GLP－1類似物，讓其既保留有GLP－1的功效，又能抵抗降解;2)DPP－Ⅳ抑制劑以提高內源性GLP－1的半衰期。

4.1.1 利拉魯肽 利拉魯肽(Liraglutide)為GLP－1受體激動劑，與GLP－1的同源性達97%，保留天然GLP－1功效，同時克服了其易被DPP－Ⅳ降解的缺點，半衰期達12～14h，成為長效藥物，僅需每日1次皮下注射就能起到良好效果，還可激活其他GLP－1受體，產生降糖以外的多種有益效應［20］。1)降糖效應無論單獨應用還是與其他降糖藥聯合應用，都具有顯著的降糖效應。降糖機制:促進胰島β細胞分泌胰島素，增加肝臟、肌肉和脂肪組織對葡萄糖的利用，有效降低餐后高血糖;抑制胰島α細胞分泌胰高血糖素，抑制糖原異生，減少肝糖輸出，有效降低空腹高血糖;增強中樞性飽食感及延遲胃排空，導致主動進食量減少而降低血糖［21］。2)β細胞保護 直接激活β細胞膜上的GLP－1受體，通過信號轉導促進β細胞增殖，減少β細胞凋亡。增強胰島素合成:增加C肽分泌，降低胰島素原/胰島素比值，逆轉糖尿病前期，顯著減少糖尿病患病率［22］。3)減輕體重 單獨應用或與其他降糖藥聯合應用，均能減輕2型糖尿病患者的體重，而且呈體重依賴性，因此有學者提出用利拉魯肽治療肥胖癥。4)心血管保護 通過降糖、降脂、降壓等，降低心血管的危險因素，增強心功能，保護心血管。在糖尿病前期及早期應用利拉魯肽，不但能有效控制血糖、延緩并發癥的發生，甚至可逆轉β細胞功能衰退，降低2型糖尿病發生率，尤其對伴有肥胖、高脂血癥、高血壓的患者更為適用［23］。

4.1.2 磷酸西他列汀 西他列汀(Sitagliptin)為選擇性降解GLP－1的DPP－IV的抑制劑，已用于T2DM治療的臨床試驗。雖然尚未發現DPP－IV抑制劑可降低體重和減緩胃排空，但DPP－IV抑制劑的許多生物活性與GLP－1R競爭藥物類似，包括增加胰島素分泌，減少胰高血糖素分泌，通過增加β細胞增殖和抑制β細胞凋亡而提升β細胞質量。對控制空腹和餐后高血糖作用明顯，并且對糖基化血紅蛋白的降低也具有顯著的臨床意義［24］。

4.2 GLP－1相關中藥

4.2.1 蜈蚣 蜈蚣為節肢動物門唇足綱整形目蜈蚣科動物，具辛溫走竄、通經逐邪之功效，為熄風鎮痙、攻毒散結之要藥，主治小兒驚風、瘡瘍、腫毒、燙傷、風癬等［25］，有研究采用SRB法檢測細胞活性的方法來篩選具有促進胰島β細胞增殖的中藥，發現中藥蜈蚣對胰島β細胞株RINm5f有顯著的促進增殖作用，且有劑量依賴關系，經中藥蜈蚣治療的糖尿病小鼠胰島素水平與模型對照組相比顯著增加。對其進行了糖尿病模型小鼠的體內藥效評價，結果顯示在體內中藥蜈蚣具有促進胰島素分泌，修復β細胞損傷和降低血糖的功能［26］。

4.2.2 大黃素 周麗嫦［27］以高糖培養基培養小鼠腸道腫瘤內分泌細胞株(STC－1)進行體外的實驗研究，以ELISA法檢測GLP－1含量，探索大黃素體外對STC－1分泌GLP－1的影響，結果大黃素可劑量依賴性地促進STC－1細胞株分泌GLP－1;利用C57BL/6J小鼠進行體內實驗研究，分析小鼠給予大黃素灌胃對口服葡萄糖負荷的小鼠分泌GLP－1及胰島素的影響，結果大黃素灌胃可提高口服負荷葡萄糖小鼠血漿GLP－1的水平。體外和體內實驗都證實，大黃素可促進GLP－1分泌。

4.2.3 黃連素 呂秋菊等［28］人的前期研究證實黃連素可能通過促糖尿病小鼠胰腺釋放胰島素來降血糖，后通過體外動物實驗發現灌服黃連素的老鼠血清GLP－1水平明顯增高，故推測黃連素可能通過誘導GLP－1釋放來間接促進胰島B細胞分泌胰島素，從而降血糖。

4.2.4 復方 動物實驗表明，茶葉多糖、枸杞多糖、杜仲水提物等中藥提取物復方也能促進體外培養的大鼠胰島細胞增殖和胰島素分泌釋放，增強胰島細胞內SOD的活性，降低MDA的生成量，從而提高胰島細胞的抗氧化能力，說明復方對離體大鼠胰島細胞有一定的保護作用，這可能為該復方能降低血糖、預防糖尿病并發癥的作用機理之一［29］。陶楓等［30－31］報道健胰方(黃芪、黃精、葛根、黃連、黃芩、山藥)和消渴湯方(天花粉、葛根、生地黃、藕汁、黃連、黃芩、知母)亦有促進2型糖尿病患者GLP－1表達和分泌的作用。鄭燕芳等［32－33］通過 MTT，Annexin V/PI法發現石斛合劑含藥血清可減少體外培養的STZ損傷后的胰島細胞凋亡，且對高脂高糖飲食+STZ造模的糖尿病大鼠的研究中發現，石斛合劑具有顯著降低高血糖大鼠的血糖，降低胰高血糖素，促進胰島素分泌;升高GLP－1，上調大鼠胰腺組織內 Bcl－2表達，下調 Bax、iNOS、P53表達水平，起到抑制胰島細胞凋亡，促進胰島體積增大及增加胰島內β細胞數目的作用。

5 展望

目前，GLP－1調控胰島細胞增殖、凋亡的完整信號轉導機制尚未完全清楚，還需要進一步研究探索。但GLP－1作為一個極具潛力的β細胞生長因子，必然是糖尿病治療的一大亮點，是糖尿病患者最大的希望之一，但GLP－1類新藥仍存在:1)作為一種新藥其較廣泛的作用靶點，臨床療效和安全性有待時間的考驗;2)費用昂貴，大大限制了臨床的使用;3)部分作用機理尚未完全清楚。故對GLP－1及其類似物應用的普遍性還需要進行持續深入的研究，而中醫藥以整體調整、辨證論治為顯著優勢特色，近年來的研究已逐步發現，一些中藥復方或中藥亦具有促進GLP－1分泌或表達的作用。因此，對中醫藥作用機制的闡明，亦將為中醫藥的臨床應用提供指導。

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