自制AFP/CEA雙標記TRFIA試劑臨床應用效果觀察

楊鳳愛，吳修宇，利定建，姚錦繡，梁 健

(陽江市人民醫院，廣東陽江529500)

血清甲胎蛋白(AFP)與癌胚抗原(CEA)是腫瘤普查中兩個最常用的指標，在惡性腫瘤的鑒別診斷、病情監測及療效評價等方面，有著重要的臨床價值［1～3］。目前臨床上采用的檢測血清AFP和CEA的方法主要是化學發光法，所用試劑均為進口，價格昂貴。2010年 3～5月，我們采用稀土離子銪(Eu3+)和釤(Sm3+)為標記物，成功研制了AFP/ CEA雙標記時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)試劑，現用其檢測410份血清標本的AFP和CEA，并將其結果與化學發光法、進口試劑檢測結果進行比較。現報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 自制AFP/CEA雙標記TRFIA試劑，以下簡稱AFP/CEA-TRFIA;AFP-CLIA試劑盒(SIEMENS公司);CEA-CLIA試劑盒(SIEMENS公司); AutoDELFIATMhAFP試劑盒(WALLAC公司);AutoDELFIATMhCEA試劑盒(WALLAC公司)。

1.1.2 質控品 國家AFP質控品(QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ，期望濃度分別為25、65和150 U/mL);國家CEA質控品(QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ，期望濃度分別為25、50和100 ng/mL)。

1.1.3 血清標本 由本院檢驗科提供，來自410例患者，共410份。

1.1.4 實驗儀器 Auto-DELFIA 1235時間分辨熒光檢測儀(Perkin Elmer公司)。

1.2 AFP、CEA檢測方法 用AFP/CEA-TRFIA試劑和RRFIA法、化學發光法和AFP/CEA-CLIA試劑盒重復檢測410份血清標本。每塊反應板用對應的AFP及CEA國家質控品QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ進行質量控制(各設2復孔)。對兩種方法檢測結果有差異的血清再次用自制 AFP/CEA-TRFIA試劑、AFP/CEA-CLIA試劑和WALLAC公司的相應單標記試劑作復核試驗(3復孔)。自制試劑檢測采用一步法進行(具體操作參照自制試劑的研制時設計的操作步驟)，其他兩種試劑均嚴格按其試劑盒內說明書進行。

1.3 結果判斷方法

1.3.1 質控考核標準 ①各質控物的平均值在允許范圍內;②重復樣本的測定結果相差在10%以內。不能同時滿足以上兩個條件的反應板結果即視為無效，需重新進行測定。

1.3.2 參考范圍 AFP-CLIA檢測結果正常范圍為0～8.1 ng/mL，CEA-CLIA為 0～5 ng/mL;Auto DELFIATMhAFP為0～8.7 U/mL(1 U/mL=1.21 ng/mL)，AutoDELFIATMhCEA為0～5 ng/mL。AFP/ CEA-TRFIA試劑參考范圍 AFP為0～12 U/mL，CEA為0～6.5 ng/mL。超出正常范圍為陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。以化學發光法檢測結果為金標準，計算靈敏度和特異度，同時繪制ROC曲線。

2 結果

2.1 可靠性考核結果 對所收集的410份血清標本用自制試劑進行測定，共用9塊反應板，每塊板均用AFP(QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ)及CEA(QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ)質控品進行質量控制(各設雙復孔)結果顯示各濃度質控物的測定平均值在允許范圍內且重復樣本的測定結果相差在10%以內，符合質控標準。

2.2 ROC曲線及曲線下面積 用自制試劑檢測結果繪制ROC曲線，結果AFP、CEA兩指標ROC曲線下面積(A z與B z)分別為0.978和0.976，說明本試劑的檢測性能優秀。

2.3 靈敏度和特異度 以化學發光法檢測結果為金標準，自制試劑檢測AFP敏感性、特異性均為97.56%;檢測 CEA敏感性 96.05%，特異性98.06%。

2.4 差異血清分析 410份血清中有10份血清AFP陰陽性檢測結果兩種方法不相同，其中假陽性3個，假陰性7個;有11份血清CEA陰陽性檢測結果兩種方法不相同，其中假陽性6個，假陰性5個。再次用自制試劑、化學發光試劑、AutoDELFIATMhAFP試劑盒和AutoDELFIATMhCEA試劑盒對這些差異血清進行重復和復核試驗。結果10份AFP差異血清用自制試劑復查前后AFP檢測結果完全相同，重復試驗符合率達100%。有7份差異血清的AFP檢測結果與AFP-CLIA、AutoDELFIATMhAFP試劑盒的測值相同;有2份差異血清(268、369號)與AutoDELFIATMhAFP試劑盒的測值相同，與 AFPCLIA試劑盒的測值不相同;有1份差異血清與AutoDELFIATMhAFP、AFP-CLIA試劑盒的測值不相同。11份CEA差異血清用自制試劑復查前后CEA檢測結果完全相同，重復試驗符合率達100%。有6份差異血清的測值與 CEA-CLIA、AutoDELFIATMhCEA試劑盒的測值相同;有2份差異血清與AutoDELFIATMhCEA試劑盒的測值相同，與CEA-CLIA試劑盒的測值不相同;有2份差異血清與 AutoDELFIATMhCEA、CEA-CLIA試劑盒測值不相同。

3 討論

由于環境污染、食物因素、生活方式以及工作壓力等因素的影響，目前世界上腫瘤的患患者數呈上升的態勢。肝癌是我國比較多見的惡性腫瘤之一，其病死率在男性中居惡性腫瘤的第3位，在女性中居第4位，每年死于肝癌的人數大約在10萬以上［4］。肝癌早期手術切除治療效果較好，但晚期由于癌細胞擴散到全身，其手術切除治愈效果差。因此，早發現、早診斷、早治療是改善肝癌預后的關鍵。血清學檢測是肝癌早發現早診斷的重要手段之一，AFP是大家公認的診斷原發性肝癌的最為特異的指標。另外，在新生兒先天愚型和神經管畸形診斷方面，AFP也是一個公認的重要指標。CEA對由內胚層分化來的腫瘤，特別是消化道腺癌具有較高的陽性檢出率，是結腸癌、胃癌等的重要檢測指標。近年來大量的研究報道證實多種腫瘤標志物的聯檢對于腫瘤的診斷極為重要，其中AFP與CEA聯合檢測有助于判別原發性和繼發性肝癌，而且對于良惡性肝病具有重要的診斷價值［5～7］。

目前對AFP和CEA兩種指標檢測的方法主要包括酶免法、放免法、化學發光法和TRFIA法。其中酶免法只能定性或半定量，放免法具有放射性污染，化學發光法一次檢測只能測定一個指標，而TRFIA是超微量檢測領域中一項新的檢測技術，具有靈敏度高，標準曲線范圍寬、標記物可穩定一年以上且無放射性污染、操作方便、能進行多標記等優點。本文研究的直接采用DTTA-Eu3+和 DTTA-Sm3+作為示蹤物建立的AFP/CEA-TRFIA方法操作簡單(一步法)、反應時間短(2 h)、線性范圍寬、特異性和精密度好，且與進口Perkin Elmer公司同類單標記試劑在樣本測定方面具有較好的相關性，一次檢測能得到兩種指標，符合人們向往已久的靈敏度高、無放射性污染、高效快捷等要求，因此在臨床檢測中具有極大的優勢。

一種新的能夠得到推廣的試劑盒必須具備與之相匹配的靈敏度、重復性、準確性、精密性、特異性和可靠性，這是評價試劑盒好壞的金標準［8］。另外，通過對大量臨床標本的檢測，并將結果與同類產品或方法進行比較、統計和分析來綜合考核與評價，也是考核體外診斷試劑臨床實際性能的重要內容，是綜合評價新研發產品敏感性和特異性的重要試驗資料。本研究參考同類單標記試劑的實驗研究方法［9，10］，用自制試劑對410份血清樣本進行檢測，并以化學發光法檢測結果為金標準計算敏感性和特異度，結果其診斷AFP與CEA陽性的敏感性分別為97.56%和 96.05%，特異性分別為 97.56%和98.06%，總符合率分別為97.56%和97.32%。兩種方法的測定值相關性良好。對差異血清的進一步檢測，顯示自制試劑的重復試驗符合率達100%，表明自制試劑穩定性好。自制試劑操作簡單(一步法)，費時短(2 h)，所需血清量少(25 μL)，在檢測性能上與目前臨床上廣泛應用的化學發光法相仿，能滿足臨床應用的需要。另外，自制試劑一次檢測可同時獲得血清中AFP和CEA兩種指標，這點對于一些珍貴的標本及在腫瘤的大規模普查上尤顯優勢，有推廣應用的價值。

對于出現差異的原因，初步考慮為以下兩個因素:①不同公司的試劑、不同檢測方法所選用的抗原和緩沖體系可能不一樣，導致所測結果有差異;②部分差異標本的測值在正常參考值范圍的上限附近，這種稱為灰區的測值有可能影響結果判斷的準確性，需要進一步作臨床追蹤檢測才可能進行試驗結果的判斷和臨床意義的分析。

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［10］徐偉文，吳英松，杭建峰，等.時間分辨熒光免疫法定量檢測AFP試劑盒臨床應用研究［J］.標記免疫分析與臨床，2006，13 (1):43-45.