HPLC測定生鮮乳中氨芐西林殘留方法的研究

文 / 劉維華 夏淑鴻 趙 娟 高建龍 武曉宏 寧夏獸藥飼料監察所

氨芐西林，又稱氨芐青霉素，是β-內酰胺類青霉素的一種。氨芐西林屬于廣譜抗生素，對草綠色鏈球菌、白喉桿菌、破傷風桿菌和放線菌的殺傷作用與青霉素相當，對腸球菌及李斯特菌的殺傷作用優于青霉素，而對耐藥葡萄球菌及其它能產生青霉素酶的細菌無作用。氨芐西林對革蘭氏染色陰性細菌有效，但易產生耐藥性。

氨芐西林的副作用主要表現為易使人體產生過敏反應，且發生率較高，可達10%以上，多發生于用藥后5 天，癥狀以皮疹、蕁麻疹或斑丘疹為最常見，偶見過敏性休克。

氨芐西林廣泛用于奶牛的巴氏桿菌病、肺炎、乳腺炎、子宮炎、腎盂腎炎、沙門氏菌腸炎的治療。如果養殖者對休藥期的規定執行不嚴格，就增大了氨芐西林殘留于生鮮乳中的隱患。氨芐西林的分子式為（2S，5R，6R）-3，3-二甲基-6-[（R）-2-氨基-2苯乙酰胺基]-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環[3.2.0]庚烷-2-甲酸的三水化合物。NY/T 829—2004規定使用高效液相色譜檢測牛奶中氨芐青霉素的殘留。文本為了更好地應用HPLC，指導實驗室工作，對其進行了方法學研究，現將試驗結果匯報如下。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 主要儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（配FLD檢測器和ALS自動進樣器）；高速冷凍離心機（HITACHI）；WSZ-100-A振蕩器（上海安亭科學儀器廠）；移液器（Fin npipette）；水浴鍋。

1.1.2 主要試劑

氨芐西林對照品（C16H19N3O4S·3H2O）：含量85.8%，批號K0210906，中國獸醫藥品監察所提供；乙腈為色譜純；三氯乙酸、甲醛溶液、濃磷酸、磷酸氫二鉀均為分析純；去離子水。

1.2 溶液制備

1.2.1 標準溶液制備

精密稱取氨芐西林對照品58.27 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得1000 μg/mL氨芐西林儲備液；精密量取儲備液100 μL，置50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，即為2 μg/mL氨芐西林工作液。

分別精密量取2 μg/mL氨芐西林工作液1.0、2.5 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，得0.2、0.5 μg/mL氨芐西林標準陽性添加溶液。

分別精密量取2 μg/mL氨芐西林工作液5、10、20、50、100、150、200、250 μL，置 10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，得1、2、4、10、20、30、40、50 μg/L氨芐西林標準系列溶液。

1.2.2 陽性添加試料制備

精密量取0.2、0.5 μg/mL氨芐西林工作液100 μL，置于4.90 mL離心后的空白生鮮乳中，使之成為4、10μg/L的陽性添加試料。

1.2.3 其它試劑配制

磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L）：稱取2.7218 g磷酸二氫鉀置于1000 mL容量瓶中，加水900 mL，用54%磷酸調pH值至3.50±0.05，加水定容至刻度。

三氯乙酸水溶液（20%）：稱取10 g三氯乙酸至50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻。

三氯乙酸水溶液（75%）：稱取35.5 g三氯乙酸置于50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻。

甲醛水溶液（7%）：量取37%甲醛9.5 mL置于50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻。乙腈水溶液（20%）：量取10 mL乙腈至50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻。

1.3 試驗步驟

取生鮮乳適量，以3500 rpm離心10 min除脂，精密量取5.00 mL下層溶液，置于塑料離心管中，加75%三氯乙酸水溶液0.50 mL，劇烈漩渦30 s。以6500 rpm離心10 min沉淀蛋白，精密量取上清液1.00 mL于10 mL螺口玻璃離心管中。

在盛有1.00 mL上清液或標準工作液的螺口玻璃離心管中，加入20%三氯乙酸水溶液0.20 mL和7%甲醛水溶液0.20 mL，劇烈漩渦30 s。加蓋擰緊封口后，置沸水浴中衍生化30 min，取出，冷卻至室溫，加入20%乙腈水溶液0.60 mL，漩渦混勻10 s，經0.45 μm親水性微孔濾膜過濾后作為待測溶液，用HPLC測定。同步作空白樣品和空白添加樣品的測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18-C18，（4.6×250）m m；流動相：0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液-20%乙腈溶液（75%+25%）；流速：1.0 mL/min；進樣量100μL；熒光檢測器激發波長346 nm，發射波長422 nm；進行多點校準，以色譜峰面積積分值定量。

1.5 計算

陽性添加試料回收率計算公式：R=K·（X- X0）/C×100%，公式中：

X：試樣多點校準測定值（μg/L）；

X0：空白多點校準測定值（μg/L）；

C：陽性添加實際濃度（μg/L）；

K：稀釋倍數（5.00+0.50）/5.00=1.1。

2 試驗結果

2.1 標準曲線

在上述色譜條件下，測定標準系列溶液吸收峰，氨芐西林的保留時間為6.1 min[色譜柱（4.6×250）mm，保留時間為9.7 min]，回歸方程為：

Y=68.11193 X+20.03117（R=0.99987）

氨芐西林液相色譜具有良好的響應值，理論板數為15200，峰面積與系列標準濃度呈良好的線性關系，線性范圍為1～50 μg/L。以3 倍信噪比計算求得儀器檢出限（LOD）為1 μg/L，以10 倍信噪比計算求得定量限（LOQ）為2 μg/L。

2.2 加標回收率

在空白試料中做4和10 μg/L 共2 個水平的陽性添加，每水平做5 份平行樣品，每份結果取平均值，考察3 批。氨芐西林的回收率、批內變異系數、批間變異系數見表1、2。

表1 氨芐西林4 μg/L添加樣品的結果

表2 氨芐西林10 μg/L添加樣品結果

2.3 不同系列濃度的氨芐西林溶液的穩定性

對不同系列濃度的氨芐西林溶液室溫（12～24 ℃）放置36 h，相同HPLC條件間隔測定，考察其穩定性。結果見表3。

表3 不同濃度氨芐西林36 h色譜峰面積變化情況

2.4 色譜柱的影響因素

用Z O R B A X S B-C18，（4.6×250）m m和Z O R B A X SB-C18，（4.6×150）mm色譜柱，分別測定氨芐西林陽性添加各5 批，使用相同色譜條件，分別做標準曲線多點校準，測定相同陽性添加樣品，加標回收率有一定差異。結果見表4。

表4 使用不同色譜柱的加標回收率測定結果比較

3 分析討論

3.1 生鮮乳樣品經高速冷凍離心除脂，三氯乙酸溶液沉淀蛋白，得到較好的提取凈化。上清液中的氨芐西林與甲醛溶液在酸性條件下，加熱衍生化，生成2-羥基-3-苯基-6-甲基吡嗪（氨芐西林熒光衍生物）。該衍生物在熒光檢測器上具有較強的、特異性的響應值，使用帶有熒光檢測器的高效液相色譜測定其吸收峰，激發波長346 nm，發射波長422 nm，與氨芐西林標準系列比較，測定殘留量。表明該方法可靠。

3.2 由標準曲線得出，HPLC法測定生鮮乳中氨芐西林含量在1～50 μg/L范圍呈良好線性關系，回歸方程相關系數R=0.99987，色譜峰具有良好響應值，峰周圍無基質峰干擾，色譜峰理論板數為15200。以3 倍信噪比計算求得儀器檢出限（LOD）為1 μg/L，以10 倍信噪比計算求得定量限（LOQ）為2 μg/L。表明該方法可信。

3.3 從加標回收試驗結果看，表1表明，氨芐西林4 μg/L陽性添加時，平均回收率為76.5%（n=15），回收率范圍為70.6%～85.8%，3 次考察批內變異系數分別為4.8%、5.5%、5.9%，批間變異系數為2.4%。表2表明，10 μg/L陽性添加氨芐西林平均回收率為76.8%（n=15），回收率范圍為72.8%～83.9%，3 次考察批內變系數為2.6%、2.1%、6.7%，批間變異系數為2.2%。2 個陽性添加樣品平均回收率差異不顯著，批間變異系數較低。表明穩定性良好。

3.4 使用相同色譜條件，待測液現配，分別室溫放置12、24、36 h。表3表明，液相色譜峰面積變化不顯著，說明批量處理樣品，在36 h內完成檢測，對測定結果不會造成較大影響。表明測定重復性良好。

3.5 使用（4.6×150）mm的色譜柱，保留時間為6.1 min，較（4.6×250）mm色譜柱保留時間提前了3 min，峰面積和峰高相應增加，回收率提高2 個百分點，但使用（4.6×150）mm 色譜柱明顯有一拖尾基質峰干擾。故選擇使用（4.6×250）mm色譜柱更可靠。

3.6 值得提出的是，并非所有樣品都有空白值，空白試樣出現吸收峰時，添加經衍生化的已知標準品進行峰面積疊加確證，空白試樣測定結果低于0.5 μg/L以下，可以忽略不計。進行氨芐西林殘留檢測時，盡量選擇無吸收峰的空白試樣。試樣除脂或沉淀蛋白不徹底，會影響衍生化，降低回收率，因此，檢測時劇烈漩渦是必要的。衍生化過程中，務必使用加蓋能密封的容器，以防止揮發；終體積力求準確，使用刻度離心管定容務必校準后使用，建議定量加入為妥。

3.7 本方法測定生鮮乳中的氨芐西林殘留，檢測條件穩定，加標回收率較高，變異系數較小，重復性好，可操作性強，應用簡單方便。對質檢部門開展生鮮乳中獸藥殘留檢驗工作具有現實指導意義。

[1] NY/T 829—2004. 牛奶中氨芐青霉素殘留檢測方法-HPLC法.

[2] 羅道栩，鄧國東，肖田安，等. 牛奶中氨芐青霉素殘留檢測方法研究. 中國獸藥雜志，2002，36（12）：21-23.

[3] 孟歡歡，陳玎玎，祁克宗. 高效毛細管電泳檢測牛奶中氨芐青霉素和阿莫西林殘留方法的建立.動物醫學進展，2008，29（1）：32-25.

[4] 付少剛，劉維華主編. 生鮮乳檢驗監管指南. 銀川：陽光出版社，2010.