非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶2與核因子—κB在糖尿病牙周炎牙周組織破壞中的作用研究

[摘要] 目的 觀察糖尿病牙周炎條件下小鼠牙周組織中非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶2（PTPN2）、核因子-κB（NF-κB）的表達與牙周組織破壞的關系。方法 將4周齡健康雄性C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組（N組）、單純牙周炎組（P組）及糖尿病牙周炎組（DP組），每組6只。采用口內接種牙齦卟啉單胞菌法在P組建立牙周炎模型，采用腹腔注射鏈脲佐菌素結合高脂高糖食物與口內接種牙齦卟啉單胞菌法在DP組建立糖尿病牙周炎模型。各組動物于P、DP組末次細菌接種4周后處死，通過體視顯微鏡觀察牙槽骨形態和附著喪失面積，采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察牙周附著喪失的高度，免疫組織化學法檢測牙周組織中PTPN2與NF-κB的表達強度。結果 P、DP組牙槽骨的附著喪失面積和牙周附著喪失高度均高于N組（P<0.05），PTPN2的表達量低于N組（P<0.05），而NF-κB的表達量則高

于N組（P<0.01）。結論 在糖尿病牙周炎的發生發展過程中，NF-κB可能有促進作用，而PTPN2可能有抑制作用；

PTPN2的表達減少可能導致NF-κB表達增強而加重牙周組織破壞。

[關鍵詞] 糖尿?。?牙周炎； 非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶2； 核因子-κB

[中圖分類號] R 781.4 [文獻標志碼] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.009

有研究[1]顯示：糖尿病患者罹患牙周炎時，其炎癥反應較非糖尿病患者嚴重，進展迅速，易造成明顯的牙周組織破壞。如何有效地預防和治療糖尿病患者的牙周炎，是目前臨床工作中的難點之一。患牙周炎時，過度的炎癥反應是造成牙槽骨等牙周組織損害的重要原因之一。侵入牙周組織的細菌能激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途徑，導致多種炎性細胞的活化和炎癥因子的過表達，促進炎癥的發生發展，最終導致牙周組織破壞[2]。有研究[3]表明：非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶2（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2，PTPN2）在免疫、炎癥反應的信號轉導中具有重要的調節作用，其表達水平降低與一些免疫、炎癥性疾病的發生發展密切相關。在糖尿病牙周炎條件下，牙周組織中PTPN2和NF-κB的表達與牙周組織破壞有何種關系，國內外的研究還較少。本文通過觀察實驗性糖尿病牙周炎小鼠模型牙周組織中PTPN2、NF-κB的表達與牙周組織破壞的關系，探討PTPN2、NF-κB蛋白在糖尿病牙周炎中參與牙周組織損害的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑和儀器

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自美國Sigma公司；PTPN2兔抗多克隆抗體（Biotech公司，美國），NF-κB鼠抗單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；

SP試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技

術有限公司）；體視顯微鏡（Olympus公司，日本），

Nikon 80i型顯微鏡（Nikon公司，日本），2035型切

片機（Leica公司，德國）。

1.2 動物分組及牙周炎小鼠模型的構建

4周齡16～18 g的健康雄性C57BL/6J小鼠18只（四川大學動物中心提供），隨機分為3組：正常對照組（N組）、單純牙周炎組（P組）及糖尿病牙周炎組（DP組），每組6只。N組按無特定病原體（specific patho-

gen free，SPF）級動物常規飼養，不做任何處理。DP組喂飼高脂高糖食物，并按55 mg·kg-1腹腔注射STZ，每天1次，連續注射5 d；末次注射1周后檢測血糖，若血糖≥16.65 mmol·L-1確認糖尿病動物模型建立成功[4]。確認建模成功1周后，各組小鼠均給予正常飲食。P、DP組在1%戊巴比妥鈉麻醉下通過口內涂布的方

式接種牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，

P.gingivalis）建立牙周炎模型。P. gingivalis的密度為

1×109 CFU·mL-1，接種0.05 mL，連續接種5次，隔日接種。接種菌液由保存菌種P. gingivalis ATCC 33277活化增菌后，挑取平板上活的單個菌落，用加入2%羥甲基纖維素的無菌PBS配成密度為1×109 CFU·mL-1的

菌懸液。接種時在小鼠每個后牙的齦溝內涂布菌液。末次接種4周后處死各組小鼠（處死動物前再次檢測血糖確定DP組小鼠血糖值≥16.65 mmol·L-1），取上下頜組織進行觀察；將上頜組織進行常規固定、脫鈣、石蠟包埋，制作切片；分離下頜軟組織，洗凈下頜骨，干燥備用。

1.3 體視顯微鏡觀察后牙牙槽骨的附著喪失面積

取各組小鼠下頜骨進行體視顯微鏡檢查，在放大15倍情況下計算全部后牙牙槽骨的附著喪失面積，即所有后牙牙槽嵴頂到釉牙骨質界之間的面積。

1.4 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察

牙周附著喪失的高度

取上頜組織沿第二磨牙頰舌向連續切片，HE染色，鏡下觀察牙周組織病損情況，計算第二磨牙頰、舌側牙周組織附著喪失高度（即牙周袋底部至釉牙骨

質界之間的高度）并取均值作為該牙的附著喪失高度。

1.5 免疫組織化學染色觀察PTPN2和NF-κB的表達

取上頜組織切片進行免疫組織化學SP法染色，PTPN2兔抗多克隆抗體（1∶100）、NF-κB鼠抗單克隆抗體（1∶100）為一抗，PBS代替一抗作為空白對照。

PTPN2、NF-κB陽性信號為細胞質或細胞核出現棕黃色顆粒。每個標本選取具有較明顯牙周炎病理表現的3張切片，每張切片在100倍視野下選取著色最強的區域，換至400倍光鏡下隨機選取5個視野拍攝

照片，應用Image Pro-plus圖像分析軟件測量每張切片的平均光密度值（average optical density，AOD）。

1.6 統計學分析

所得數據經SPSS 13.0軟件進行處理，結果用x±s表示，組間差異采用完全隨機設計單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 體視顯微鏡觀察結果

體視顯微鏡下，下頜后牙牙槽骨附著喪失面積的測量結果見表1，其形態學變化見圖1。

由表1可見：N組的附著喪失面積低于P和DP組，其差異有統計學意義（P<0.05）；P組和DP組附著喪失面積的差異無統計學意義（P>0.05）。由圖1可見：N組牙槽骨形態較正常，未出現明顯骨吸收（圖1A）；P、DP組可見牙槽嵴頂高度降低，牙槽骨表面有骨吸收陷窩，根分叉暴露（圖1B、C）。

2.2 HE染色結果

采用HE染色觀察上頜牙槽骨的形態學變化見圖2，其附著喪失高度的測量結果見表1。由圖2可見：

N組附著喪失很少（圖2A）；P、DP組有牙周袋形成，上皮釘突增生成網狀，牙周組織中有慢性炎細胞浸潤（圖2B、C）。由表1可見：N組的附著喪失高度小

于P和DP組（P<0.05），而P和DP組附著喪失高度的差異無統計學意義（P>0.05）。

2.3 免疫組織化學染色結果

3組的免疫組織化學染色情況見圖3，其AOD測量結果見表1：PTPN2蛋白在正常牙齦上皮細胞、牙周結締組織細胞的細胞質與細胞核中均有表達，在N組的表達強度高于P組及DP組（P<0.05），而P組和

DP組表達的差異無統計學意義（P>0.05）；NF-κB表達于牙周組織細胞的細胞質與細胞核中，在N組的表達強度明顯低于P組及DP組（P<0.01），而P組和DP組表達強度的差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

牙周炎是主要的口腔疾病之一，在糖尿病患者中具有較高的發病率，是糖尿病的第六大并發癥。因其常導致嚴重的附著喪失與骨吸收，極大地影響患者的生活質量，所以糖尿病牙周炎的發生發展機制及防治手段在牙周疾病研究中倍受關注。

患有糖尿病時，宿主對病原微生物產生的過度炎癥反應是造成牙周組織破壞的重要原因。作為一種真核細胞轉錄因子，NF-κB的激活與多種炎癥性疾病密切相關。在正常生理情況下，NF-κB常與其抑制蛋白（inhibitor κB，I-κB）家族成員結合，以無活性復合物的形式存在于細胞中；當病原微生物及其產物如內毒素等細胞外信號作用于細胞時，可激活相應受體將信號傳導入細胞內，使I-κB磷酸化并與NF-κB解離，導致NF-κB進入細胞核內與特異的DNA序列結合，調節靶基因轉錄和表達，促進炎癥的發生發展[5]。有學者[6]發現：牙周炎患者牙周組織

細胞的細胞核及細胞質中NF-κB的激活率遠高于正常組織；在另外的研究[7-8]中發現：牙周致病菌P. gin-

givalis侵入牙齦上皮細胞時會激活NF-κB途徑，引起白細胞介素等炎癥因子的生成增加，并可趨化中性粒細胞等炎細胞到感染部位，引發炎癥反應。此外，NF-κB可抑制中性粒細胞等炎細胞的正常凋亡，使其死亡從而崩解釋放多種破壞牙周組織的酶，增強炎癥反應[2]。已有研究[9]發現：NF-κB與糖尿病狀態

下的炎癥損傷調節有重要的關系，降低NF-κB的水平可有效改善糖尿病患者神經系統的炎性病變。本實驗結果顯示：與正常對照組相比，糖尿病牙周炎小鼠的牙周組織有明顯的附著喪失，出現牙周袋及炎細胞浸潤，且NF-κB表達增強。其可能機制為細菌感染牙周組織時，牙齦成纖維細胞、巨噬細胞等細胞的NF-κB途徑被激活，引起白細胞介素、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥因子釋放，趨化并活化炎癥細胞，釋放更多的炎性介質，致使炎癥反應加劇并加重組織損傷，如誘導結締組織間質細胞產生基質金屬蛋白酶使間質中的膠原降解，刺激基質細胞凋亡限制牙周組織修復，促進破骨細胞分化及骨吸收等[10-11]。有學者[12]發現，在糖尿病條件下，巨噬細胞、中性粒細胞等細胞對細菌釋放的內毒素的反應更為敏感，能釋放更多的炎癥因子，并使炎癥反應延長，這能促進糖尿病并發的炎癥反應出現嚴重的破壞且進展迅速。本實驗中，DP組小鼠的牙周附著喪失量、NF-κB表達量的測量值與P組的差異無統計學意義，可以考慮在下一步實驗中采用Micro CT、實時熒光聚合酶鏈反應、免疫印跡法等靈敏度更高的方法進一步檢測組間的差異。

PTPN2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的重要成員，有兩種mRNA編輯方式：一種編碼形成相對分子質量為4.8×104的蛋白質，稱為TC48，定位于內質網和高爾基復合體；另一種編碼形成相對分子質量為4.5×104的蛋白質，稱為TC45，定位在細胞核內[3]。TC45發

揮主要的生物學作用，當細胞受到刺激后，TC45游離出細胞核，使細胞質內的蛋白質，如表皮生長因子受體、蛋白酪氨酸激酶（Janus kinase，JAK）、信號轉導與轉錄激活因子（signal transducer and activator of

transcription，STAT）等去磷酸化，抑制下游信號通路的轉導，調節炎癥和免疫反應[3]。在敲除PTPN2的動

物模型體內，血清中腫瘤壞死因子等炎癥介質的水平升高，并出現廣泛而嚴重的炎癥性疾病[13]。本實

驗發現，DP組和P組小鼠的牙周組織中出現明顯的組織破壞及炎癥反應，同時PTPN2的表達低于N組，提示PTPN2的表達水平下降可能是造成牙周炎癥反應加劇及組織損傷的原因之一?？赡軝C制是PTPN2能抑制巨噬細胞產生TNF-α，并與腫瘤壞死因子受體相關因子-2相互作用，抑制TNF-α介導的炎癥反應；它能使集落刺激因子-1受體及Src酪氨酸激酶去磷酸化，進而調節Erk信號轉導通路，抑制單核細胞的增殖、分化與炎性反應；它可降低JAK的酪氨酸磷酸化程度，并可使STAT上的酪氨酸去磷酸化以調節STAT的活性，進一步下調JAK/STAT信號通路的傳導，從而抑制干擾素-γ、白細胞介素-6介導的基因表達與炎癥反應，減少組織損害[14-15]，而PTPN2表達減少時，這些作用減弱，可以加速牙周組織的破壞。

本實驗顯示，與正常小鼠相比，糖尿病牙周炎

與單純牙周炎小鼠的牙周組織中PTPN2表達減少，

同時NF-κB表達增高，提示PTPN2可能通過調節NF-κB的表達影響牙周炎的進程，其機制可能是PTPN2表達下降，抑制巨噬細胞分泌TNF-α以及抑制TNF-α介導的炎癥反應作用減弱，而TNF-α可以促使中性粒細胞活化并釋放活性氧，使I-κB磷酸化并激活NF-κB信號轉導通路，進而加重炎癥反應及組織破壞[16]。

綜上所述，本實驗觀察到糖尿病牙周炎時牙周組織中NF-κB表達增強，PTPN2表達減弱，提示在糖尿病牙周炎的發生發展過程中，NF-κB可能有促進作用，PTPN2可能有抑制作用，且PTPN2的表達水平下降可能導致NF-κB表達增多而加重牙周組織的破壞。了解這些因子相互作用的機制及其與牙周破壞之間的關系，有助于為今后尋找糖尿病牙周炎的防治措施提供新思路。

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（本文編輯 吳愛華）