白色念珠菌檢測方法的研究進展

歐陽珂珮，劉生峰，肖進文，李應國，李洪軍，賀稚非

(1.西南大學食品科學院，重慶400715; 2.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶400020; 3.重慶市進出口食品安全工程技術研究中心，重慶400020 4.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶400715)

白色念珠菌檢測方法的研究進展

歐陽珂珮1，2，3，4，劉生峰2，3，肖進文2，3，李應國2，3，李洪軍1，4，*，賀稚非1，4

(1.西南大學食品科學院，重慶400715; 2.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶400020; 3.重慶市進出口食品安全工程技術研究中心，重慶400020 4.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶400715)

白色念珠菌是導致真菌感染的重要致病菌之一，文章對白色念珠菌的生物學特性和檢測方法進行了綜述。目前我國尚未出臺食品中白色念珠菌檢測的相關標準。本文通過對白色念珠菌檢測技術發展歷程的梳理，旨在為廣大科研工作者、行業法規制定者提供一些參考依據。

白色念珠菌，特性，檢測方法

1 白色念珠菌的生物學特性

1.1 一般特性

白色念珠菌(Candida Albicans)又稱白假絲酵母菌，廣泛存在于自然界，也存在于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道，一般在正常機體中數量少，不引起疾病，為條件致病性。當機體抵抗力降低或菌群失調時，白色念珠菌就會繁殖并改變生長形式侵入人體細胞從而引起疾病。

白色念珠菌細胞呈卵圓形，致病性菌株細胞呈現假菌絲。該菌在血瓊脂或沙保氏瓊脂上，以37℃或室溫孵育2～3d后，生成灰白乳酪樣菌落，涂片鏡檢，可看到表層為卵圓形芽生細胞，底層有較多假菌絲。若接種于4%玉蜀黍瓊脂上，室溫孵育3～5d可見假菌絲，芽生孢子，厚膜孢子。白色念珠菌對熱的抵抗力不強，加熱至60℃，1h后即可死亡。但對干燥、日光、紫外線及化學制劑等抵抗力較強。

1.2 白色念珠菌的致病性研究

1.2.1 致典型癥狀及易感人群 白色念珠菌引起淺表性感染和深部感染，該種菌引起的相關疾病有皮膚念珠菌病，包括指(趾)間糜爛，多見于長期從事潮濕作業的人、念珠菌性間擦疹多見于小兒和肥胖多汗者、丘疹形念珠菌病多見于肥胖兒童、念珠菌性甲溝炎、甲床炎多見于指甲;粘膜念珠菌病，包括多見于嬰幼兒患者的鵝口瘡，以及生殖器念珠菌病;而深部感染疾病則包括內臟念珠菌病，該感染可累及全身所有內臟器官，其中以腸念珠菌病及肺念珠菌病較常見。此外，可引起泌尿道炎、腎孟腎炎、心內膜炎及腦膜炎等，偶見其引發念珠菌性敗血癥。念珠菌疹，即念珠菌及其代謝產物引起的皮膚變態反應，主要損害為成群的無菌性水皰，多見于手指間;也可見到銀屑病樣、玫瑰糠疹樣、脂溢性皮炎樣、蕁麻疹樣、離心性環狀紅斑樣損害。

1.2.2 導致念珠菌感染的因素 念珠菌病主要是白色念珠菌引起的急性、亞急性或慢性感染，是最常見的真菌病。臨床癥狀錯綜復雜，急緩不一，兒童多為急性繼發性感染。該病常侵犯皮膚、粘膜，也可引起內臟或全身感染。所有內臟感染常繼發于多種慢性消耗性疾病，且有長期應用廣譜抗生素、皮質激素及化療、放療等誘發因素。近年來隨著大劑量抗生素、激素、免疫抑制劑的應用，以及器官移植術的開展，其發病率漸趨增高，并可危及生命造成嚴重后果。

除了引起淺表性感染的酵母型之外，所謂的假菌絲體是類酵母真菌的另一種形態學表現。芽管和假菌絲體的產生主要發生在侵入性感染的病人體內。此外，念珠菌屬酵母菌能夠產生和分泌多種酶，使兼性病原體微生物能夠穿透血管和粘膜屏障。念珠菌屬各種病菌一般是通過污物的污染進行傳播的，主要的入口是鼻咽通道，但脂肪酸、酸性pH和敵對性菌群等也會引起皮膚表面抑制真菌感染的功能障礙，從而導致淺表性的念珠菌病。病菌感染粘膜后，侵入性的念珠菌病會從胃腸道向外傳播。

2 白色念珠菌的檢測方法介紹

白色念珠菌的檢測方法主要分為傳統培養結合生理生化鑒定以及基于分子生物學所發展的快速檢測方法兩種。

2.1 以微生物培養為主的傳統檢測方法

目前國內食品檢驗機構對白色念珠菌的檢測幾乎全是利用白色念珠菌的形態特征和生理生化特性，用微生物培養的傳統方法對白色念珠菌進行分離鑒定的方法。

對于食品中白色念珠菌的檢測，目前主要參照參考文獻［1］中所述標準方法進行檢測。首先增菌培養，取供試液10mL(相當于供試品 1g、1mL、10cm2)直接或處理后接種至適量(不少于100mL)的沙氏葡萄糖液體培養基中，培養48～72h。然后，取上述培養物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基培養基平板上，培養24～48h(必要時延長至72h)。根據菌落形態初步判定。

白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養時間稍久則菌落增大，顏色變深，質地變硬或有褶皺。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形態特征相符或疑似，應挑選2～3個菌落分別接種至念珠菌顯色培養基平板上，培養24～48h(必要時延長至72h)。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%聚山梨酯80－玉米瓊脂培養基上，培養24～48h。取培養物進行染色、鏡檢及芽管實驗。此外，也有相關文獻報道了白色念珠菌在各類培養基上的菌落特征，便于用以檢驗判定該菌存在。

白色念珠菌在1%聚山梨酯80－玉米瓊脂培養基上呈灰色或奶油色，表面光滑有濃酵母氣味，培養時間稍久則菌落增大，顏色變深、質地變硬或有皺摺。白色念珠菌在血平板上呈灰色或奶油色，表面光滑有濃酵母氣味，培養時間稍久則菌落增大，顏色變深、質地變硬或有皺摺。白色念珠菌在TTC(氯化三苯四氮唑－沙氏瓊脂培養基)培養基平板上呈乳白色或淡紅色，菌落小，其他酵母菌為紅色、熱帶念珠菌為深紅色或紫色。通過培養法初步鑒定后，要用白金鉺挑取少量的培養物，進行芽管試驗進行最終判定。

中國藥典(2010版)中對四種推薦使用培養基做了比較，其中除了沙氏葡萄糖液體培養基只具有促生長能力外，沙氏葡萄糖瓊脂培養基、1%聚山梨酯80－玉米瓊脂培養基、念珠菌顯色培養基都具有促生長能力與指示能力。其中念珠菌顯色培養基還具有抑制大腸埃希菌的能力。

目前山東出入境檢驗檢疫局等單位正在制定進出口食品白色念珠菌的檢測方法行業標準。包括中國藥典中對白色念珠菌的檢測都是以上述經典培養方法為基礎，其準確性、快速性均有提升空間。

而國外關于利用微生物培養法鑒定白色念珠菌的研究在上世紀 90年代有所報道。在 1994年Patricia Rousselle和 Anne－Marie Freydiere［2］采用Albicans ID和Fluoroplate兩種商業上可用的固體培養基進行白色念珠菌的快速鑒定。發色體或熒光團被放置在這兩種培養基的底層，以便于檢測和鑒定白色念珠菌。實驗對723個酵母菌株及352個白色念珠菌菌株的1006個臨床樣本進行了檢測。這兩種培養基的靈敏度為別為93.8%及98.6%，并且對熱帶念珠菌有5個假陽性反應，無假陰性反應。

2.2 以分子生物學為基礎的快速分析法

自上世紀80年代起，以分子生物學為基礎的快速分析法已經開始興起，近年來在醫學界對白色念珠菌的檢測已經深入到亞型之間的鑒定，并且有相當快速的檢測方法，能夠區分死菌活菌、致病型非致病型，從而提高了白色念珠菌的檢測精度和檢測效率。

上世紀末，關于白色念珠菌的檢測方法有濕片法、免疫血清檢查、培養觀察菌落特征和菌體形態及生化特性檢驗、動物接種等。濕片法敏感性較低(30%～50%)［3］，由于白色念珠菌可在人體的一些部位正常寄居，其孢子可存在于正常人體［4］并與人體某些組織間有共同抗原［5］，使免疫血清鑒定缺乏特異性。并且由于白色念珠菌存在兩種表型:酵母相和菌絲相，前者為芽孢和出芽，為無癥狀寄居的表型;后者為芽管和菌絲，為致病狀態的表型;醫學上檢測必須同時觀察到孢子和菌絲才有診斷意義。動物接種等方法較為可靠，但手續繁瑣、耗時長，對早期診斷不利，難以推廣。因此上世紀已經有相關分子生物學的先進手段應用于深部白色念珠菌感染病患的檢測。

之后，隨著分子生物學研究的不斷深入，手段的不斷提高，新的技術也普遍應用于白色念珠菌的檢測中，并且出現了許多能夠靈敏快速的區分鑒定出白色念珠菌及念珠菌屬其他菌種的方法。

2.2.1 白色念珠菌基因研究為快速分析法的建立提供理論依據 早在2003年人類已經完成了白色念珠菌的全基因測序，這也是迄今為止第一個，也是唯一一個完成測序的致病真菌微生物。有關白色念珠菌的功能基因的相關研究自上世紀末起也在不斷的深入。這些相關基因的報道及其作用機制的闡明對白色念珠菌快速檢測無疑提供了非常強大的理論保障。白色念珠菌的功能基因包括結構基因，形態相關基因、代謝相關基因、基因信息傳遞基因、致病基因、耐藥基因等［6］。相關基因所控制的生化反應以及表達產物都為分析方法的建立提供了理論依據。

目前研究較多并應用于分析檢測方面的熱點主要集中在粘附性蛋白相關的基因、致病性基因及結構基因及其表達所涉及蛋白等方面。

早在1996年Spreghini［7］等在研究白色念珠菌表面玻連蛋白(VN)受體時發現，αvβ3或αvβ5整合素的抗體可抑制白色念珠菌黏附于波連蛋白(VN)，從而推測αvβ3和αvβ5整合素作為白色念珠菌表面的VN受體介導黏附。2001年Klotz［8］等發現白色念珠菌表面存在一種醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)并推測其為介導白色念珠菌黏附于FN和VN的酶類。

1999年Kinneberg［9］等認為白色念珠菌INT1基因對其菌絲生長、黏附作用和致病性均有作用。而2002年Wiesner等［10］研究INT1變異的白色念珠菌時更進一步的發現，INT1基因對菌株的黏附性的影響與菌株所處的形態有關，當菌株處于酵母態時，INT1基因促進起黏附作用，但當菌株呈菌絲態時則沒有作用。

1999年Stmdstrom［11］認為HWP1作為芽管、菌絲中特有的黏附素，是通過轉谷丙酰氨酶(transglutaminase，TGase)機制介導白色念珠菌與頰黏膜上皮黏附的。2002年Sundstrom［12］研究了三種(Hwp1p、Ala1p/Als5p、Als1p)來自白色念珠菌的結構相關性黏附素并闡明了其黏附作用的機制。Fu等［13］發現白色念珠菌可同時調節菌絲生長與細胞間凝集的糖蛋白Als1p，該蛋白基因的表達受轉錄因子Efg1p控制。Gaur等［14］研究了Ala1/Als5p基因及其粘附特性，得出特定氨基酸對于Ala1/Als5p基因的介導黏附有著識別作用。Zhang等［15］則認為ALS基因家族所編碼的蛋白參與介導白色念珠茵與內皮細胞、上皮細胞的黏附。

2.2.2 上世紀白色念珠菌快速分析法的發展軌跡

2.2.2.1 以核酸為目標的快速檢測方法 早在1993年，ANN R.HOLMES［16］等人就利用白色念珠菌中rRNA編碼區互補的引物進行PCR，以此來檢測含有不同念珠菌種的血液樣本中菌種的DNA。他們研究并報道了一個只在白色念珠菌的DNA中擴增出來的684bp的片段，白色念珠菌檢測的敏感度為(15± 5)CFU/mL血液。同年，YOZO MIYAKAWA等人［17］研究了一種利用PCR來擴增一個種間特異含有125bp堿基的DNA片段。DNA模版中還加入了熱帶念珠菌和能跟兩種細胞都反應的抗體。這種組合將白色念珠菌的檢測靈敏度提高到了3CFU/0.1mL。1994年ANN R.HOLMES［16］又報道了基于5S rDNA的PCR擴增和相鄰DNA區域的基因(NTS)所設計的靈敏、快速檢測白色念珠菌或血液樣本中的其他念珠菌的方法。

除了普通PCR技術的應用，分子雜交以及熒光探針也出現在早期白色念珠菌快速分析法的研究中。1996年Axel Lischewski，Rudolf I.Amann［18］設計了一條能與白色念珠菌和熱帶念珠菌185rRNA相結合的熒光標記的寡核苷酸探針。應用該條探針進行熒光原位雜交能夠很容易的將白色念珠菌從其它細胞中區分開來。

隨著生物學上對白色念珠菌研究的進一步深入，相關基因的發現，給白色念珠菌在21世紀能夠被廣泛深入的研究打下了良好基礎。

2.2.2.2 以蛋白質等其他大分子為目標的快速檢測方法 除了利用基因作為檢測對象的分析方法的建立外，也有許多研究者將目光投向了具有免疫特性的功能蛋白與受體上。

1999年Mardh PA等人［19］于2002年報道了直接免疫熒光法檢測白色念珠菌，直接免疫熒光技術與間接免疫熒光技術相比，前者背景染色淺、簡單易行、用時少、易于區分正常寄居和致病狀態。目前這種方法被推廣應用于婦女白色念珠菌陰道炎的檢測中。

2.3 白色念珠菌快速檢測方法的發展趨勢

近年來，早期的白色念珠菌快速檢測方法不斷地優化實驗條件、簡化實驗步驟、降低檢測成本。此外，新的檢測方法向著速度更快、檢測限更低、通量更高、能夠同時檢測多種微生物的方向發展，熒光定量PCR、RNA印跡雜交等諸多新技術已越來越普遍地應用于白色念珠菌的快速檢測中來。

2.3.1 以PCR技術為核心的新型PCR檢測方法蓬勃發展 2003年盧雪紅、羅萍等［20］應用復合 PCR法，檢測老年人未感染的及已感染的腹膜透出液中的金黃色葡萄球菌和白色念珠菌。復合PCR法與傳統培養方法相比具有快速、特異、敏感的優點，并發現近年來老年人腹透液中白色念珠菌感染率明顯增高。

Mirhendi等［21］報道了一種新的引物，可以同時用于普通PCR和PCR－RFLP方法檢測白色念珠菌，當PCR用于檢測純化的DNA時，此方法的精確度大約為1pg真菌DNA。

Kyle T.Beggs，Ann R.Holmes等人［22］設計了針對口腔中白色念珠菌反轉錄的特異性引物，對白色念珠菌mRNA進行了檢測。

Silvia Arancia等人［23］報道了利用CaMP65特異性探針實時熒光定量PCR分析，建立了一種快速檢測和量化白念珠菌的生物樣品(血、尿和血清)的方法。

Grzegorz Kofla等人［24］在研究中利用實時熒光定量PCR(TaqMan)試驗做了簡短的報道，對MDR1，CDR1和ERG11的基因表達水平的量化分析。

Huaguo Xiang等人［25］設計了一對通用引物，其靶向從28S rRNA到5.8S rRNA的基因區域ITS2區，用來擴增6種PCR念珠菌屬的致病菌包括C.albicans，C.tropicalis，C.krusei，C.glabrata，C. parapsilosis，C.dubliniensis。實驗結果該方法檢出率和靈敏度遠高于培養法和濕片法。

2008年劉有旺等人［26］報道了一種快速檢測奶牛酵母菌性乳腺炎的方法，研究人員根據白色念珠菌ITS1－ITS2部分的保守序列設計了一對特異性引物，建立了PCR檢測方法。實驗表明，方法的特異性為100%，敏感性檢測的最低濃度為:1.25×103CFU/mL，該方法具有快速、準確和特異的優點。

2.3.2 結合物理新方法的應用嘗試 2009年Rafael Mulero等人［27］提出了一種新的檢測方法，它利用恒定電流通過微孔，測量當單獨的念珠菌改變位置或通過微管時，外部電流形態的變化，從而計算出其濃度含量。這種方法在白色念珠菌的檢測上尚屬首次。也成為白色念珠菌快速檢測法研究的新視角。

3 結論

國內外食品藥品中常檢出白色念珠菌，該菌的致病性已引起國內外廣泛關注，因此，在食品藥品中檢測白色念珠菌具有重要的衛生意義。目前食品中容易被白色念珠菌所污染的第一大類產品就是乳制品。由于奶牛酵母菌性乳腺炎大多數是由白色念珠菌引起的，因此感染該病癥的牛所產牛乳有可能也帶有致病菌。此外藥食同源的中藥材以及其制品中也易帶菌。

國外已對該致病菌做了相關風險分析，如《日本藥典》(第15版)對用前需加開水的草藥的微生物指標中都規定了(10g樣品中)不能檢出白色念珠菌的限量要求。但我國目前仍未正式出臺相應的國家標準和行業標準，因此迫切需要制定相關標準以便于我國食品藥品檢驗監管，從而保障我國人民食品藥品安全，并促進進出口食品、中藥材安全衛生標準與國際接軌。目前國家檢驗檢疫局已經開始著手制定相關行業的行業標準，相信在不久的將來，白色念珠菌的檢測水平的提高將推動我國食品安全上升到新的高度。

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Research progress on the detection method of Candida albicans

OUYANG Ke－pei1，2，3，4，LIU Sheng－feng2，3，XIAO Jin－wen2，3，LI Ying－guo2，3，LI Hong－jun1，4，*，HE Zhi－fei1，4
(1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China; 2.Chongqing Entry＆Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chongqing 400020，China; 3.Chongqing Import and Export Food Safety Engineering Technology Research Center，Chongqing 400020，China; 4.Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center，Chongqing 400715，China)

Candida albicans is one of the most important pathogens in fungal infection.The progresses in the recent studies related to the biologic characterizations and the detcction method of Candida albicans was reviewed.At present our country had not yet been introduced food of Candida albicans in testing standards.This article researched of Candida albicans detection technology development history，wanted to provide some references for the majority of researchers and industry law makers.

Candida albicans;characterizations;detection method

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0420－05

近年來，隨著人類環境、疾病等方面的改變，真菌類感染的發病率呈現逐年上升的趨勢，白色念珠菌是導致真菌感染的重要致病菌之一，此外它還是重要的食源性致病菌。因此，開展白色念珠菌檢測方法研究在醫學臨床檢驗、食品安全檢測領域都具有重要意義。目前，有關白色念珠菌快速檢測的相關報道多見于國內外醫學領域，在食品檢測方面尚屬空白，國內外也沒有出臺相關的行業標準。目前國內所采用的方法和正在制定的標準采用的方法也都是傳統方法，這些方法易產生假陽性的情況，且耗時長。采用PCR、熒光定量PCR方法不僅可以快速檢測白色念珠菌，還可以準確定量。由于白色念珠菌是一種條件致病菌，其致病性與之存在量效關系，因此定量檢測方法的建立對判斷食品受污染的程度以及可食用性無疑有著重要的意義。另外，采用RT－PCR的方法可以快速鑒定區分白色念珠菌死菌與活菌，亦可了解食品原料加工中受污染的情況。

2011－12－16 *通訊聯系人

歐陽珂珮(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品生物技術。

重慶市科委攻關項目(CSTS2011AC1057);質檢公益項目(201010045)。